MicroRNAs對動脈粥樣硬化關鍵信號分子的影響

袁緒勝，戴 敏，2，3

(1.安徽中醫學院藥學院，2.安徽省中藥研究與開發重點實驗室，3.省部共建新安醫學教育部重點實驗室，安徽合肥 230031)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性、增殖性和血管炎性疾病［1］，以血管內皮細胞(vascular endothelial cells，VECs)受損、血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增生為主要病理特征［2］。VECs的激活與損傷發生在血管炎癥的始動階段，VECs極易受到周圍有害因素，如:氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和高糖等的影響而發生功能和結構的改變［3］。當血管受到損傷時，VECs分泌功能失調，通過產生的細胞炎性因子、生長因子等活性物質影響VSMCs增殖的信號，改變VSMCs基因的表達［4］，導致中膜VSMCs的功能、結構發生改變，從中膜移行穿過內彈力板進入內膜并發生增殖［5］。

microRNAs(miRNAs)是一類生物進化過程中高度保守的，由內源基因編碼的，含21～24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。miRNAs通過降解mRNA或抑制蛋白質翻譯，調控人類20% ～30%的基因表達［6］。miRNAs在心血管系統中調控信號轉錄后的基因表達，在AS形成和發展的炎癥機制中，miRNAs參與VECs激活與損傷過程的信號通路的磷酸化、信號的轉導和VSMCs的表型轉化、增殖與遷移［7］。本文從VECs損傷和VSMCs增殖與遷移的角度來綜述miRNAs對AS關鍵信號分子的影響。

1 miRNAs調控基因的表達和AS

miRNAs作為一種基因表達的調控因子，在AS發生與發展過程中高表達。miRNAs通過其靶點，調控各種細胞因子、炎性分子等表達進而直接或間接影響AS的病理進程。脂質沉積于血管內皮下能夠損傷VECs，伴隨著單核－巨噬細胞浸潤與吞噬，泡沫細胞的產生以及炎癥介質分泌增多，最終導致 AS形成［8］。Xu等［9］最早發現 miRNAs與血脂之間的關聯，新近研究表明miRNAs是脂質代謝的調節因子。miRNA-14沉默組動物的甘油三酯和甘油二酯升高，而增加miRNA-14表達后，其血脂水平便可恢復正常，表明miRNA-14具有降低血脂的作用。采用反義寡核苷酸抑制miRNA-122，可明顯降低正常小鼠體內血漿中膽固醇水平，而對肥胖小鼠模型，不僅降低血漿膽固醇水平，還改善肝臟的脂肪變性［10］。

miRNAs可以從不同水平上調節基因表達，起到類似蛋白質的調節作用。miRNAs在血管細胞內調節多種重要作用。在胚胎發育過程中，miRNAs可促進血管發育，miRNAs表達失調會導致血管發育異常。最早的證據為Dicer敲除的小鼠表現出明顯的血管新生缺陷［11］。此后的研究表明涉及血管表達的miRNAs通過影響VECs、VSMCs等的功能來調控血管發育。

miRNAs在物種間具有高度的保守性、時序性和組織特異性。miRNAs表達的時序性和組織特異性提示miRNAs的分布可能影響組織和細胞的功能特異性，也可能參與復雜的基因調控過程，對組織的發育起重要作用。一些特異性的表達于心血管系統的miRNAs參與心血管的發育及疾病發生過程，通過體內外實驗確認其部分靶基因，提供了分子層面研究miRNAs功能的方法［12］。在 AS形成的過程中，多種miRNAs特異性的調控血管細胞因子、炎性因子等的表達，影響血管壁的功能與結構。同時，由于miRNAs與靶基因間存在著復雜的調控網絡，精細的調控著血管壁上基因的表達［13］，通過miRNAs調控基因的表達，將穩定斑塊、延緩AS斑塊進展，進而減少心血管事件。

大多數miRNAs與靶mRNA的3'非翻譯區(untranslated region，UTR)結合，部分miRNAs與開放閱讀框(open reading frame，ORF)或5'UTR結合，抑制靶mRNAs的翻譯或降解靶mRNAs，抑制的程度和 miRNAs結合位點的數目有關［14］。miRNAs通過與靶基因的3'UTR上的靶序列結合，發揮其基因沉默效應［15］，從轉錄后水平對生物體內基因時序性表達起到精細調節作用。miRNAs參與了血管細胞的發育、損傷、凋亡、增殖等多種生物學過程，它的表達在多種心血管系統生理病理過程中也具有重要的調控作用［16］。盡管大多數miRNAs的功能未知，但新發現的miRNAs對基因表達的調控，可能提供研究AS等心血管疾病病理機制新視角。

2 miRNAs和VECs信號分子

當外界因素損傷或激活VECs，細胞的通透性增加，表面的黏附分子(ICAM-1、VCAM-1和E-選擇素等)表達增加，VECs表面黏附力增強，而使其發生凋亡［17］。血液中的單核細胞易黏附并遷移入血管內膜，進入內膜后的單核細胞增殖分化為巨噬細胞，表達清道夫受體并介導攝取脂蛋白而變成泡沫細胞，產生氧自由基、炎性細胞因子以及蛋白酶等介導的免疫反應。

miRNAs參與并調控VECs激活與損傷過程。miRNAs主要通過調節血管內皮功能和結構的完整性、細胞炎性因子和黏附分子的表達、VECs的增殖與遷移和參與血管形成的能力等途徑實現對VECs的作用。當外界因素刺激VECs時，miRNA-21、miRNA-125a、miRNA-126、miRNA-221 和 miRNA-222等多種miRNAs在VECs中高水平表達［18］。

VECs中存在較豐富的miRNA-21，但涉及miRNA-21生物學意義的相關研究很少，Ji等［19］采用大鼠頸動脈球囊損傷模型觀察了血管損傷后miRNAs的變化規律，發現球囊損傷后血管組織中miRNA-21表達明顯上調。采用反義寡核苷酸敲除miRNA-21可抑制頸動脈內膜球囊損傷后的血管內膜增生，說明miRNA-21能夠促進血管內膜的增生。miRNA-125a調控炎癥性細胞因子的表達水平，其抑制ox-LDL刺激的巨噬細胞對脂質的攝取，并減少炎癥因子如 IL-2、IL-6、TNF-α 等的分泌與釋放［20］。miRNA-126與 VECs的損傷修復具有緊密的聯系，Wang等［21］研究表明內皮細胞特異性的miRNA-126通過增加VECs生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)的表達，抑制負調控基因Spred-1的表達而促進血管形成。敲除miRNA-126基因，新生小鼠VECs增殖、遷移受限，導致血管內膜不完整，血管形成障礙。VCAM-1是miRNA-126的靶基因，降低 miRNA-126的表達水平，會導致TNF-α誘導的VCAM-1表達上調，從而促進單核細胞在VECs的黏附［22］。miRNA-221和 miRNA-222對內皮祖細胞具有調節作用，同時參與內皮細胞的增殖與分化，在VECs損傷后修復過程中發揮著重要的調控作用［23］。

3 miRNAs和VSMCs信號分子

VECs損傷與激活后，釋放細胞炎性因子、生長因子等，這些活性物質通過受體，激活VSMCs，使其由收縮表型轉化為合成表型，增殖由中膜向內膜遷移，吞噬脂質轉化為泡沫細胞。在AS形成與發展的過程中，miRNA-21、miRNA-143、miRNA-145、miRNA-155、miRNA-221 和 miRNA-222 等 在VSMCs中特異性的表達，調控VSMCs表型的轉化、增殖與遷移，影響 AS 的形成［24］。

在體外培養的VSMCs中miRNA-21表達增加，通過下調靶基因程序性死亡因子4(PDCD4)的表達，調節VSMCs收縮表型相關基因的表達，參與骨形態發生蛋白誘導的VSMCs收縮表型的轉變［25］。LiuY 等［26］報道過氧化氫處理VSMCs后可引起miRNA-21表達明顯上調，miRNA-21過表達可減少細胞凋亡，而miRNA-21抑制后增加過氧化氫誘導的VSMCs死亡和凋亡。miRNA-21通過調節VSMCs中PDCD4及激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)途徑發揮對抗過氧化氫損害的平滑肌細胞保護效應。血管內膜增生是AS病變中內膜損傷的表現，miRNA-21是內膜增殖的重要調控因子，抑制miRNA-21可能通過作用B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)和磷酸酶基因(PTEN)抑制血管內膜增生。miRNA-21的抑制劑可以劑量依賴性的誘導細胞凋亡，減少細胞增殖［27］。

Cordes等［28］確認 miRNA-143和 miRNA-145分別作用于轉錄因子EIK-1(Ets-like transcription factor-1)和細胞周期抑制因子KFL-4，體外試驗證明miRNA-143和miRNA-145通過抑制平滑肌細胞增殖，促進細胞的分化，在VSMCs的命運決定和可塑性方面發揮關鍵的作用。Cheng等［29］報道了過表達miRNA-145通過抑制KFL-5的表達抑制大鼠頸動脈球囊損傷造成的內膜新生。

miRNA-155作為免疫細胞中重要的調控因子在VSMCs中也有表達。血管緊張素II-1型受體(AT-1R)是miRNA-155的一個靶基因，AT-1R激活后可促進VSMCs的增殖和遷移，因此miRNA-155可能通過抑制AT-1R的表達抑制血管緊張素 II(AngII)信號介導的血管增生過程［30］。Zhang等［31］研究表明，大鼠頸動脈損傷及血管成形術后，miRNA-21和miRNA-221、miRNA-222在受損的動脈平滑肌細胞中大量表達，損傷處血管平滑肌增生，管腔狹窄。下調miRNA-21、miRNA-221和miRNA-222的表達，明顯抑制了VSMCs的增殖。進一步研究發現，miRNA-221和miRNA-222通過調節p27和p57基因的表達，抑制VSMCs的增殖效應。

4 miRNAs在信號分子介導通路中的調控作用

miRNAs通過負性調節特異性的靶基因，參與VECs和VSMCs信號分子的活化與轉導，發揮細胞活性的調節作用。Cui等［32］發現，近30%的信號網絡蛋白為miRNAs的靶基因，而在人類基因組中，miRNAs的靶基因僅占總基因數的17%左右，這提示miRNAs更傾向于選擇信號轉導通路上的蛋白為靶向，因而在信號調控方面扮演著更為重要的角色。Yoo等［33］的研究首次提及miRNAs參與到信號分子介導的通路中并能影響細胞的分化轉歸，他們闡述miRNA-61與細胞表面的受體LN-12/Notch及短日節奏基因VAV-1之間的相互聯系，它調控體內與細胞的發育分化有關的信號分子。miRNA-61與基因VAV-1的mRNA 3'UTR互補，抑制VAV-1蛋白的表達，受VAV-1抑制的LN-12活性反而增高，這樣LN-12、miRNA-61及VAV-1形成了一個反饋環，使得LN-12的活性最大化。

miRNAs在免疫炎癥細胞因子信號轉導的過程中發揮重要的調節作用。用LPS刺激人單核細胞系巨噬細胞株(THP-1)后，用芯片技術檢測200個成熟miRNAs的表達，發現 miRNA-132、miRNA-146和 miRNA-155的表達水平升高［34］。進一步研究miRNA-146對Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)配體和一些細胞因子刺激的反應情況，結果顯示TLR2、TLR4和TLR5的配體可以明顯刺激miRNA-146表達上調［35］，miRNA-146是通過TLRs信號傳導通路負反饋調控機制下調參與炎癥反應［36］。利用微陣列技術研究TLRs信號通路活化后淋巴細胞miRNAs的表達情況，發現TLR2、TLR4和TLR9的配體都能夠依賴不同的銜接蛋白活化核因子NF-κB和AP-1，引起miRNA-155的積累，干擾素(interferon，IFN)-β 則需首先增強 TNF-α 的合成，通過 TNF-α 自分泌途徑活化自身JNK信號通路，進而刺激miRNA-155的產生［37］。

在刺激細胞的胞內信號傳導途徑中，研究較多的是絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)，它在細胞反應中起著重要作用。在哺乳動物細胞中至少己克隆了 ERK、JNK、p38和NEK 4個 MAPK 亞族，其他包括 NF-κB、PKC、PI3K、G 蛋白等信號傳導途徑在內毒素激活細胞中也起重要作用。miRNA-101可以通過靶向絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶(MKP-1)mRNA的3’UTR來調節MAPK的反應，進而影響下游炎癥因子的分泌。PI3K/AKT通路通過調控miRNA-101的表達，影響MKP-1以及MAPK的表達和活化情況，這表示PI3K/AKT通路可以通過miRNA-101與MAPK通路進行串擾［38］。若miRNA-101被抑制，導致MKP-1大幅度上調而降低了MAPK活化作用。同時，miRNA-126通過抑制血管新生的負調控因子Spred-1和PI3K受體的表達參與血管新生信號轉導，參與損傷血管細胞的修復，維持血管完整性。

由此可見，miRNAs對細胞信號分子通路的調節作用是多種多樣的，它既可以通過關閉一些關鍵基因來影響細胞的增殖、分化和轉歸，也可能與其靶基因產物相互作用形成調節環并與其他調節通路交織作用形成網絡調控機制。

5 結語與展望

miRNAs作為一類具有重要調控作用的內源性小RNA分子，通過調節靶基因mRNAs的穩定性或抑制翻譯而發揮作用，使miRNAs成為新的治療措施。明確各種miRNAs的直接靶標以及不同組織中的特異性miRNAs，進一步尋找并驗證靶基因是闡明miRNAs功能與作用機制的一個重要方面。盡管現在已開發出多種生物信息學分析軟件可以預測miRNAs的潛在靶基因，然而僅有少數一些靶基因被驗證。miRNAs在AS形成的炎癥機制中扮演著重要角色，但 miRNAs和AS形成與發展關系的研究尚處在起步階段，哪些miRNAs在AS發生發展過程中發揮調控作用?它們是如何發揮相互作用共同組建調控網絡的?一系列問題還有待深入探討。研究miRNAs對AS病理的調控影響和作用機制，有助于我們從新的領域和視角認識心血管系統相關的生理、病理變化過程，為AS病理機制的研究找到新的切入點，為研發抗AS新藥開拓新的思路。

近年來，盡管miRNAs在心血管疾病中作用的研究取得了令人矚目的成果，證實miRNAs參與調控心血管系統多種相關蛋白的表達，但miRNAs在心血管系統中的生物學行為仍然是新的研究領域，miRNAs在心血管系統中的作用靶點和作用機制尚待發現，需要挖掘不同心血管疾病中miRNAs的表達模式、調控的靶基因以及參與的信號通路等。把計算機分析技術、生物信息學、細胞生物學和功能基因組學等先進科學技術方法相互結合，將有助于推動miRNAs在心血管疾病中的研究，豐富我們對心血管生理和病理方面的認識，并將推動和擴展心血管疾病治療思路與方法的研究。

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