芍藥苷通過調節前列腺素E2受體抑制大鼠成纖維滑膜細胞增殖

汪慶童，馬昱琨，黃 蓓，魏 偉

(安徽醫科大學臨床藥理研究所，抗炎免疫藥理學省部共建教育部重點實驗室，安徽合肥 230032)

滑膜炎是類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)這一自身免疫性關節疾病的特征性病理表現，其中成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)異常增殖活化［1－2］。前列腺素 E2(prostaglandin E2，PGE2)通過受體 EP(E-prostanoid)2和 EP4介導興奮性G蛋白(stimulatory G protein，Gs)信號通路調節細胞內環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)水平和DNA合成而發揮致炎作用，是滑膜細胞活化導致滑膜炎的重要病理機制之一［3－4］。課題組研究發現，臨床使用的天然藥物白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)，其活性單體為芍藥苷(paeoniflorin，Pae)，可以降低膠原性關節炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠滑膜細胞中抑制性G蛋白(inhibitory G protein，Gi)的表達，恢復cAMP水平和蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)活性［5］。本研究在以往工作的基礎上，從調節EP2受體及信號通路的角度，觀察Pae抑制PGE2誘導的大鼠FLS異常增殖的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物 Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質量(120±20)g，♂，由安徽醫科大學動物實驗中心提供，合格證號:皖醫實動準字第01號。

1.2 主要試劑 Pae，白色粉末，由安徽醫科大學臨床藥理研究所化學室提供，高效液相法測純度＞95%(LC-10AD高效液相色譜儀，日本);氚標記的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)購于中國科學院上海應用物理研究所;兔抗大鼠β-arrestin 2和EP2一抗，小鼠抗大鼠β-actin一抗，辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG抗體和免抗鼠IgG抗體均購于Santa Cruz公司;cAMP放免檢測試劑盒為北京華英生物技術研究所產品。

1.3 FLS的分離培養 大鼠處死后，置于0.1%新潔爾滅液中浸泡15 min，于膝關節正中縱行切開皮膚，分離肌肉，露出膝蓋骨，繼續向下分離，可見平滑光亮的滑膜組織。用手術刀分離關節囊的滑膜層和纖維層，然后取出滑膜層組織。去除脂肪、纖維等，用D-Hank's液(無 Ca2+、Mg2+，含青霉素200 kU·L－1、鏈霉素 200 mg·L－1)反復沖洗后剪成 1 ～2 mm3小塊，用玻璃吸管吸取均勻排列于培養瓶(預先用含20%胎牛血清DMEM培養液濕潤)的底壁，瓶底朝上，37℃、5%CO2培養箱中培養6 h，使其貼壁。再輕輕翻轉培養瓶，使培養液剛剛覆蓋組織塊，每隔2～3天換一次培養液，觀察到有大量成纖維細胞長出后輕輕去除組織塊，繼續培養，待細胞快長滿時用0.25%胰蛋白酶消化細胞并傳代培養，取第3～5代細胞用于實驗。

1.4 FLS增殖反應 將培養得到的FLS分為正常組、PGE2125 μg·L－1刺激組及 PGE2刺激 +Pae 1、10、100 nmol·L－1，1、10 μmol·L－1給藥組，作用 24 h。采用3H-TdR參入法，終止培養前6 h每孔加入20 μl3H-TdR，培養結束后收集細胞，用液閃儀(LS6500液體閃爍計數儀，Beckman公司)測其放射性，結果以3個復孔cpm的均值表示。

1.5 FLS內cAMP濃度檢測 取第3代FLS，每孔1×109cells·L－1接種于24孔板，給藥后培養24 h，PBS洗滌細胞1次，每孔加50 mmol·L－1醋酸緩沖液1 ml終止反應，用槍頭將孔底細胞刮下，移入1.5 ml eppendorf管，細胞超聲破碎，4℃ 1 200×g離心5 min，取上清液，－20℃保存，按照125I cAMP放免試劑盒說明書進行，使用γ-911全自動放免計數儀(中國科技大學實業總公司生產)測定。

1.6 流式細胞術檢測FLS細胞表面EP2的表達細胞給藥處理后，PBS洗滌細胞1次，0.25%胰蛋白酶消化細胞，PBS洗滌1次后用4%多聚甲醛室溫固定 40 min，2 000 r·min－1離心 10 min，去上清后，用含0.5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的PBS重懸細胞，加入兔源性抗EP2受體一抗(1∶50)，37℃孵育30 min，離心去上清重懸沉淀，加FITC標記的羊抗兔二抗(1∶200)37℃避光孵育20 min，網紗過濾后用流式細胞儀(Beckman FC500)檢測。

1.7 Western blot法檢測 β-arrestin 2胞膜和總表達以及EP2的總表達 取第3代FLS，每孔1×109cells·L－1接種于6孔板，各組給藥后培養24 h，加入RIPA裂解液后超聲降解，提取總蛋白，100 000 r·min－1離心1 h，沉淀物為胞膜蛋白，用裂解液溶解，加入上樣緩沖液煮沸變性后進行SDS-PAGE電泳(5%的濃縮膠和10%的分離膠)，轉膜，5%的脫脂奶粉37℃封閉2 h，加抗β-arrestin 2或EP2(1∶1 000)抗體，內參用β-actin單克隆抗體，4℃孵育過夜，洗膜，加辣根過氧化物酶標記的相應二抗(1∶30 000)37℃孵育2 h，ECL法顯影，分析條帶灰度值。實驗重復3次，以目的條帶與β-actin條帶的灰度比值來表示蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 Pae抑制PGE2誘導的大鼠FLS異常增殖對不同濃度 PGE2(1、5、25、125、615 μg·L－1)作用不同時間(12、24、36、48、60 h)誘導 FLS 的增殖預實驗結果提示，PGE2125 μg·L－1為刺激的亞適濃度，24 h為最適時間，這一條件用于本實驗。第3代大鼠 FLS 體外用 PGE2125 μg·L－1刺激，同時加入不同濃度的 Pae，培養24 h，3H-TdR參入法檢測 FLS的增殖能力。從Fig 1中可以看出，PGE2明顯促進FLS 的增殖(P＜0.01)，Pae 10、100 nmol·L－1，1、10 μmol·L－1不同程度抑制FLS的增殖。

Fig 1 Effect of Pae on proliferation of PGE2-induced rat FLS(±s，n=5)

2.2 Pae恢復PGE2降低的FLS內cAMP濃度用放免法檢測各

組FLS內cAMP水平，如Fig 2所示，PGE2作用24 h后降低了細胞內的cAMP濃度，Pae體外給藥可以逐步升高cAMP濃度，其中Pae 100 nmol·L－1，1、10 μmol·L－1對 cAMP 水平有明顯影響(P＜0.05或P＜0.01)。

2.3 Pae對細胞膜EP2受體表達的影響 采用流式細胞術檢測不同濃度Pae對PGE2作用下FLS細胞膜EP2受體表達情況(Fig 3A～E)，去除非特異性染色后，比較X軸平均熒光強度的變化(Fig 3F)。統計發現，正常大鼠FLS細胞膜上EP2受體的平均熒光強度為23.33±4.54，PGE2作用24 h后，EP2胞膜表達降低(15.23±1.30，與正常組比較P＜0.01)，Pae不同濃度體外給藥升高EP2的胞膜表達(Pae 1 μmol·L－1為 19.73 ± 1.70，Pae 10 μmol·L－1為20.20 ±2.23)。

Fig 2 Effect of Pae on cAMP concerntration in PGE2-induced rat FLS(±s，n=5)

Fig 3 Effect of Pae on membrane EP2 expression in rat FLS treated by PGE2( ± s，n=4)

2.4 Pae對PGE2誘導的大鼠FLS總β-arrestin 2和EP2以及胞膜β-arrestin 2表達的影響 大鼠FLS裂解后經超速離心，分離出胞膜蛋白，Western blot法檢測細胞胞膜和總蛋白的表達情況，結果顯示PGE2作用下，FLS總β-arrestin 2、EP2以及胞膜β-arrestin 2 表達均升高，Pae 1、10 μmol·L－1可明顯降低細胞總EP2和β-arrestin 2的表達，Pae 3個濃度可不同程度抑制胞膜β-arrestin 2表達。

Fig 4 Effect of Pae on membrane β-arrestin 2，total EP2 and β-arrestin 2 expression in rat FLS treated by PGE2(±s，n=3)

3 討論

滑膜炎中FLS異常增殖活化，隨之形成血管翳，逐漸向關節面和關節軟骨擴散、侵蝕，并最終破壞關節軟骨和軟骨下骨，使關節畸形而失去功能［6］。多種信號轉導參與了FLS的異常增殖，研究發現，作為最大受體超家族的G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)介導的信號通路在RA FLS過度增殖中發揮了重要的作用。關節炎動物模型的FLS存在G蛋白的含量變化和功能障礙，cAMP水平和PKA活性降低［7］。EP2和EP4是表達于滑膜細胞膜上的重要GPCRs，均與Gs蛋白偶聯［4］。本課題組研究發現，佐劑性關節炎(adjuvantinduced arthritis，AA)大鼠FLS的EP2受體表達升高［7］，但為何細胞內cAMP水平和PKA活性反而降低?本實驗發現PGE2誘導的大鼠FLS總EP2蛋白表達升高，與前期研究一致，但細胞膜EP2受體表達水平低于正常細胞，導致對Gs信號激活減弱，cAMP產生減少。

活化的FLS細胞膜EP2受體為何減少?我們檢測了GPCRs重要的負調節因子之一β-arrestin 2。β-arrestin與GPCRs激酶(G-protein-coupled receptor kinases，GRKs)聯合作用，通過介導受體脫敏和內吞，對大部分GPCRs信號轉導通路具有重要的負調節作用［8］。當GPCRs被激活后，β-arrestin轉移到細胞膜，結合到被激動劑占領的受體上，促使這些受體與G蛋白分離，從而導致受體脫敏。活化的β-arrestin分子釋放出C末端，與胞內小泡表面的網格蛋白(clathrin)結合，介導 GPCRs的內吞。β-arrestin可以調節內吞后GPCRs的運輸模式，在GPCRs循環中起到了特別的作用［9］。β-arrestin有 β-arrestin 1和2兩個亞型，廣泛的存在于各種細胞中。β-arrestin 1還可以進入細胞核內直接或間接影響一些轉錄因子，在基因表達調控上發揮更多的功能，βarrestin 2主要介導受體的調節和信號轉導［10］。CIA大鼠滑膜細胞β-arrestin 1，2表達的增高與病程一致，在關節炎癥高峰期表達最高，TGP體內給藥抑制FLS中 β-arrestin 1，2 的表達水平［11］。本實驗進一步發現活化的FLS總β-arrestin 2和胞膜β-arrestin 2表達均升高，提示在PGE2刺激下，由于β-arrestin 2產生和募集到胞膜上的量增多，介導了EP2受體的內吞，從而降低了Gs下游信號分子cAMP的水平，引起FLS異常增殖。

目前RA的治療效果仍不盡人意，天然藥物因療效肯定，不良反應少顯示出了廣闊的應用前景。白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)已經作為一個抗炎免疫調節藥被正式批準生產上市，用于治療RA等疾病。前期研究發現，TGP的主要有效成分Pae可以升高cAMP水平和PKA活性，改善滑膜細胞功能［12－13］。本實驗觀察到Pae通過減少細胞膜β-arrestin 2的富集，升高細胞膜EP2受體水平，改善Gs信號通路，從而提高FLS內cAMP水平，抑制PGE2刺激下FLS的過度增殖，這一分子機制可能部分解釋Pae發揮作用的分子機制。然而，Pae如何影響到細胞內的β-arrestin 2，進而發揮調節細胞表面GPCRs數量和活性的作用，仍需進一步闡明。

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