糖尿病小鼠小腸黏膜胰島素受體的研究

張獻(xiàn)彩 劉秀敏 李軍改 張麗娜

(邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 河北邢臺(tái) 054000)

臨床上糖尿病常引起多種消化道癥狀，病人常表現(xiàn)為腹瀉、便秘、上腹脹痛等癥狀[1],其發(fā)病機(jī)制尚不太清楚。現(xiàn)在大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為糖尿病胃腸功能紊亂的發(fā)病機(jī)制主要與胃腸的自主神經(jīng)病變有關(guān)，也有臨床和實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)在無(wú)自主神經(jīng)病變時(shí)亦可出現(xiàn)胃腸功能紊亂[2]。但有關(guān)小腸黏膜上胰島素受體和杯狀細(xì)胞研究較少，鑒于此，利用免疫組化和PAS染色方法觀察糖尿病小鼠小腸黏膜上胰島素受體是否改變,為進(jìn)一步研究糖尿病的消化系統(tǒng)并發(fā)癥提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物來(lái)源 引進(jìn)日本C57bl/ksj-db/+m轉(zhuǎn)基因小鼠。

1.1.2 動(dòng)物分組 病例組：選取3、5、6、8、10月齡db/db自發(fā)性糖尿小鼠，每組6只。對(duì)照組：選取相應(yīng)年齡段db/+m表型正常小鼠，每組6只。

1.2 免疫組化步驟

(1)脫蠟至水;(2)蒸餾水洗5min×3次;(3)3%甲醇-H2O2室溫孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;(4)蒸餾水洗5min×3次;(5)枸櫞酸鈉緩沖液微波爐內(nèi)抗原修復(fù)約30min;(6)滴加10%正常山羊血清封閉，濕盒內(nèi)孵育約10min;(7)滴加兔抗胰島素受體，濕盒內(nèi)過(guò)夜;(8)0.01M PBS緩沖液洗5min×3次;(9)滴加生物素標(biāo)記的二抗（羊抗兔），放入濕盒內(nèi)孵育2h;(10)緩沖液洗5min×3次;(12) 滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液，濕盒內(nèi)孵育2h;(13)緩沖液洗5min×3次;(14)14DAB顯色,木精復(fù)染細(xì)胞核。

陰性對(duì)照用0.01M PBS代替一抗，其余步驟同上。結(jié)果判定：細(xì)胞內(nèi)有棕黃色分布的為陽(yáng)性反應(yīng)。

2 結(jié)果

胰島素受體（IR）在小腸黏膜主要表達(dá)在上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，在黏膜下層和肌層的細(xì)胞也有IR的表達(dá)。糖尿病組（DM）比同月份正常對(duì)照組（N）IR的表達(dá)量明顯減少(P<0.05，P<0.01)，糖尿病組中5月齡IR的表達(dá)量最高，10月齡表達(dá)的最少，并且5月齡與10月齡均存在著顯著差異（P<0.05），正常對(duì)照組隨月齡增長(zhǎng)無(wú)顯著性差異（P>0.05）

3 討論

胰島素受體廣泛分布于全身各組織細(xì)胞內(nèi)，胰島素受體是一種糖蛋白，是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路上的連接蛋白，主要連接胰島素受體（IR）和多種效應(yīng)分子。

胰島素受體由2個(gè)α亞基及2個(gè)β亞基即α2β2構(gòu)成，α亞基及β亞基通過(guò)-s-s鍵相連，α亞基在細(xì)胞膜外表面，分子量130kD,由723個(gè)氨基酸構(gòu)成，具有與胰島素或IGF特異結(jié)合部位，β亞基跨膜存在于胞質(zhì)內(nèi)，分子量95kD，由620個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。

胰島素是胰島β細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)激素，體內(nèi)發(fā)揮重要的生理作用，必須經(jīng)過(guò)以下幾步:（1）胰島素與胰島素受體α亞基結(jié)合;（2）胰島素受體β亞基中近膜結(jié)構(gòu)域與胰島素受體底物結(jié)合，隨之發(fā)生一系列生化反應(yīng)，使其信號(hào)得以轉(zhuǎn)導(dǎo)和放大;（3）產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)。在上述過(guò)程中任何一個(gè)或數(shù)個(gè)環(huán)節(jié)的異常均可導(dǎo)致胰島素抵抗。大量資料表明2型糖尿病與胰島素抵抗有十分密切的關(guān)系[3]，學(xué)者們從各個(gè)環(huán)節(jié)研究了2型糖尿病時(shí)胰島素抵抗發(fā)生的機(jī)制，對(duì)胰島素受體這個(gè)環(huán)節(jié)也不例外，研究較多是非腸道組織如肝、脂肪組織、紅細(xì)胞等細(xì)胞上的胰島素受體的變化，但對(duì)腸道組織小腸黏膜的胰島素受體研究相對(duì)來(lái)說(shuō)較少，故本研究應(yīng)用免疫組化來(lái)探討糖尿病小鼠小腸黏膜上胰島素受體的蛋白表達(dá)，結(jié)果表明糖尿病時(shí)小腸黏膜上胰島素受體的蛋白表達(dá)量比同月份正常對(duì)照組降低，這與糖尿病時(shí)非腸道組織的胰島素受體變化一致，并且Ziegler,TR等研究發(fā)現(xiàn)大鼠小腸胰島素受體與典型的胰島素靶組織的受體完全相同，并且胰島素受體在結(jié)構(gòu)上具有同源性，所以小腸黏膜的胰島素受體水平可反映胰島素受體的總體水平。糖尿病時(shí)糖尿病小鼠小腸黏膜的胰島素受體蛋白表達(dá)量減少，那么正常劑量的胰島素與其結(jié)合的數(shù)量要少，故它的生物學(xué)效應(yīng)要降低，從而說(shuō)明此種糖尿病小鼠存在著胰島素抵抗。

[1]李卉，劉芳,王常林,等.糖尿病腹瀉的發(fā)病機(jī)制及中西醫(yī)治療[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25（1）：50～51.

[2]Talley NJ, Young L,Bytzer P,et al.Impact of chronic gastrointestinal symptoms in diabetes mellitus on health-related quality of life[J].Am J Gastroenterol,2005,96(1):71～76.

[3]Kahn CR,Weir Gc.Joslin’s Diabetes Mellitus,Molecular Aspect of Insulin Action.13 Edition.published by lea＆Febiger Company:pressed in philished,1995,8:139.