中藥鑒定方法的研究進展①

劉淑蘭

（黑龍江中醫藥大學 哈爾濱 150000）

中藥鑒定是鑒別中藥的真偽、優劣,質量好壞的有效方法。傳統鑒定的方法即以四大鑒定(來源鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定、理化鑒定)為主要方法。近20多年來,隨著對中藥研究的深人,現代化科學技術的滲透,中藥鑒定新技術得到了飛速發展,現將近20年來的中藥鑒定方法的內容和應用做一簡要綜述。

1 基原鑒定

基原鑒定是應用植(動、礦)物的分類學知識,對中藥的來源進行鑒定研究,確定其正確的學名,以保證應用品種準確無誤[1]。

1.1 經典形態分類學

傳統上中藥的物種分類鑒定和親緣關系的確認,一直運用經典的形態分類學方法,通過觀察植物形態、核對文獻和標本,進行原植物鑒定,確定正確的學名,以確保在應用中品種準確無誤。近年來我國學者在這方面進行了大量研究,取得了長足的進展[2]為進一步開展中藥研究提供根本保證。

1.2 細胞生物學技術

主要是利用細胞染色體資料來進行分類的技術[3]。某個特定種群的生物體細胞中染色體的數目、形態、組型、帶型是穩定不變的,代表著該種群的基本遺傳特征[4]。由于染色體形態只能在細胞分裂中后期觀察,因此該方法只適用于果實和種子類藥材鑒定,將其培養發芽后,取根尖制片,觀察并找到較好的染色體排列,制成核型模式圖。測定染色體長臂和短臂長度,計算同源染色體相對長度及臂長比值、著絲點指數、差值,求出核型公式,根據“不對稱核型分類”標準確定其核型,與已知該植物染色體的背景資料比較,確定藥材種屬[5]。該方法已被用于中藥梔子等的鑒定。

1.3 分子生物學技術

分子生物學是從分子水平研究生物體的生命活動及其規律的一門科學,其應用于中藥品質鑒定領域,為中藥鑒定提供了一個嶄新的研究思路。分子水平一般有蛋白質肽譜、同功酶譜及及DNA圖譜。目前應用于中藥鑒定的主要有以下三類。

1.3.1 電泳技術 中藥電泳鑒別法是根據動植物類藥材中所含有的有機酸、蛋白質、多肽、氨基酸、生物堿和酶等.其電荷性、電荷數和分子量各不相同,在電場作用下,經一定時問,各成分泳動的方向、速度和距離也不相同,結合譜帶條數和染色結果的差異,達到分離鑒別的目的。電泳技術目前已廣泛應用于中藥品質鑒定中。通過聚丙烯酰氨凝膠電泳圖譜鑒別莧科6種種子類藥材[6]。

1.3.2 免疫技術 不同的動植物藥材含有不同的特異蛋白,利用該特異蛋白為抗原制各的特異抗體與檢品中的特異抗原結合產生沉淀反應來鑒別藥材的真偽為免疫鑒別。該技術適用于動物藥材的鑒別,尤其是親緣關系比較接近的動物藥間的鑒別[7]。郭月秋等[8]根據這一技術原理,對鹿心及其偽品進行鑒別,此方法快速而準確。

1.3.3 DNA分子遺傳標記技術 DNA分子遺傳標記技術是直接分析生物的基因型來鑒別藥材。DNA分子標記技術因目前應用的主要有聚合酶鏈式反應(PCR)、限制性內切酶酶切片段長度多態性(RFLP)、隨機擴增的多態性DNA(RAPD)以及DNA測序等技術。在目前絕大多數動植物中藥材DNA序列尚不清楚的情況下,比其他分子標記更有廣闊的前景。DNA分子標記已經有許多應用,如對金銀花藥材[9]、郁金[10]、當歸和大黃種子[11]的鑒別。

2 顯微鑒別

顯微鑒別是利用顯微鏡來觀察中藥粉末所具有的器官構造、組織構造碎片、細胞形狀以及內含物的特征,以此來鑒別制劑的處方組成以及藥材真偽。楊穎[12]對牛黃及其偽品進行了顯微鑒別,天然牛黃可見不規則團快,內有黃棕色或紅棕色小顆粒集成的類方形晶體,遇水合氯醛色素迅速融解并顯明金黃色,久置變綠色。偽品均無天然牛黃的特征。

3 理化鑒別

理化鑒別是針對中藥所含主要學成分或有效成分,采用物理或化學方法進行鑒別,包括熒法、顯色法、沉淀法、升華法、結晶法等。一般用于性狀相似又無明顯顯微鑒別特征且化學成分不同的藥材。馬洪梅[13]巴戟天及其偽品羊角藤進行了理化鑒別,出現不同的熒光澤。林苗[14]等對山豆根及其混淆品朱砂根進行了理化鑒別,二者顏色變化及沉淀行為均有不同。

4 現代鑒別方法

4.1 色譜鑒別

色譜鑒別是指使用薄層色譜、氣相色譜、液相色譜和連用技術對中藥進行鑒別。

4.1.1 薄層色譜法 薄層色譜(TLC)鑒別可以在一塊層析板上容納多個樣品及出現多個信息,適合于天然藥物特別是中成藥組成成分復雜的情況,它具有分離和鑒定的雙重作用。徐列波[15]等采用薄層色譜法成功鑒別了赤芍及其偽品地榆。結果顯示,地榆在赤芍苷對照樣品相應的位置上不具斑點。

4.1.2 氣相色譜法 氣相色譜法(GC)可以分析氣體及有一定揮發性的液體和固體樣品。郭曉玲[16]等采用氣相色譜法,對高要、石牌、吳川、遂溪、雷州及海南萬年產廣藿香揮發油進行GC圖譜的比較分析,建立了廣藿香揮發油的特征指紋圖譜,可用于廣藿香的品質控制及產地鑒別。沈振鐸[17]等采用氣相色譜法對26批五味子藥材進行測定,通過南、北五味子GC指紋圖譜差異可以很容易地將它們相互區別開來。

4.1.3 高效液相色譜法 高效液相色譜法(HPLC)作為一項高效、快速的分離分析技術,在中藥領域已得到廣泛應用,幾乎所有的中藥有效成分均可進行HPLC分離分析,是中藥指紋圖譜研究的常用手段。運用梯度洗脫和二極管陣列監測器,還可以得到分辨率高的三維色譜圖,因而可以較全面地檢測中藥材中多種成分分布的全貌。李正國[18]等使用高效液相色譜法對半夏水提物進行了檢測,確定了9個峰作為鑒別半夏藥材與半夏替用品和偽品的群體特征峰,為半夏藥材的鑒定提供了重要參考。陳閩軍[19]等用高效液相色譜法獲得川芎藥材的色譜圖,從中提取15個色譜峰可用作指紋特征,結果表明不同產地川芎的指紋圖譜存在明顯差異,可用于川芎藥材的產地鑒別。

4.2 光譜鑒別

光譜鑒別的基本原理是利用中藥光譜學行為的不同,記錄其光譜用于鑒別。其常用方法有:紫外檢測法、紅外光譜法、近紅外光譜法、質譜法、X射線衍射法等。

4.2.1 紫外光譜法 紫外鑒別是將中藥進行提取,對其提取液采用紫外測定法對中藥進行評價。趙駿[20]等利用紫外法測定了不同生長期及不同產地荷葉中荷葉堿的含量,為荷葉的質量評價提供了依據。

4.2.2 紅外光譜法 紅外光譜法是將中藥粉末或其不同極性溶劑提取物采用壓片法或涂片法在紅外光譜區進行測定得到紅外光譜,根據圖譜差異進行鑒別。周欣[21]等采用采用傅里葉變換紅外光譜法(FTIR)分析鑒別了7個不同產地的陳皮揮發油,其指紋特征可作為陳皮道地藥材的一種簡單、快速的鑒別依據。張韜[22]等建立了勝紅薊不同提取物的紅外光譜鑒別法。結合勝紅薊中含揮發油、黃酮及各種苷類的紅外特征將光譜圖分為3個區段，試驗結果表明用極性不同溶劑提取的藥材其提取物與藥材殘渣的紅外光譜在這3個區段有顯著的差異。

4.2.3 近紅外光譜法 近紅外光指可見光譜區到中紅外光譜區之間的電磁波,譜區范圍為780～2526nm(12820-3959cm-1),其光譜信息來源于分子內部振動的倍頻與合頻吸收,并且主要反映分子中C-H,N-H,O-H基團的倍頻和合頻振動吸收。丁念亞[13]等應用近紅外漫反射光譜分析技術對幾種常見中藥建立了一種簡單、快速、有效的分類和真偽鑒別方法。

4.2.4 質譜法及聯用技術 質譜法是在真空系統中將樣品分子離解成帶電的離子,并通過對生成離子的質量和強度測定,而進行樣品成分和結構分析的方法。趙陸華[24]等采用氣相-質譜聯用法對13個產地烏骨藤指紋圖譜的相似度研究,評價了不同產地烏骨藤的質量。張語遲[15]等通過HPLC-ESI-MS指紋圖譜對中藥西洋參與北沙參進行了鑒別，方法簡單準確，重現性好，具有實用價值。

4.2.5 X射線衍射法 X射線衍射法是利用各藥材的相組成、成分各不相同,被X射線照射而產生不同程度的衍射現象,產生特有的衍射圖譜的方法對中藥進行鑒定的方法。張漢明[26]等對200多種中藥和成藥進行分析,得到較滿意的結果。但是衍射法的應用對于成分和晶型均為相同或極少差異的藥材鑒別仍然比較困難,故有其專用范圍。

4.2.6 廣義二維相關光譜法 廣義二維相關光譜法是指對一般光譜進行相關性分析,得到光譜的二維尺度信息,包括同步相關光譜和異步相關光譜。對于一個待分析體系,對其施加一個外部微擾,則體系會產生一個動態的變化,其光譜行為就會發生變化,運用相關分析對其譜圖進行處理,可得到二維相關光譜。JunLu等[27]等將廣義二維相關光譜應用于4個產地枸杞藥材的鑒別,說明其能區分重疊嚴重的近紅外光譜,發現中藥的近紅外特征,為枸杞提供一種便捷直觀的鑒別方法。劉浩[28]等應用二維相關近紅外光譜分析方法,借助于計算機,將近紅外光譜從一維拓展到二維,研究了變溫過程中香加皮的近紅外指紋圖譜,并與五加皮進行了比較,代替了繁瑣的色譜指紋圖譜等傳統分析手段,實現了快速無損鑒別。

5 蛋白電泳法鑒別

高效毛細管電泳fHPCE)是近年發展起來的新技術,具有高效、快速、樣本體積小和分析范圍廣闊等優點。王德先[29]用此技術較容易的鑒別了天麻及其4種偽品。該方法也適于氨基酸、蛋白質、生物堿及動物類藥材的鑒別。

6 免疫法

不同的動植物藥材含有不同的特異蛋白,免疫鑒別即利用該蛋白制備的特異抗體與待檢品中的特異抗原結合產生沉淀反應來鑒別藥材的真偽。該技術適用于動物藥材的鑒別,尤其是親緣關系比較接近的動物藥間的鑒別[30]。國內學者[31]采用免疫電泳法及瓊脂免疫擴散法準確鑒定了虎、豹等多種動物的骨骼,還能將豹骨進一步鑒定為雪豹、石豹或金錢豹,說明免疫鑒別方法是一種特異性很強的鑒別法。

7 指紋圖譜法

中藥指紋圖譜技術[32]是指某中藥材或中成藥中所共有的,具有特征性的某類或幾種成分的色譜或光譜的圖譜。即用一定的方法(如HPLC、GC、TLC、HPLC-MS、GC-MS、FTIR、x-ray和UV等),對特定的對象(如中藥材、提取物、飲片、注射液等)和過程進行分析。得到的有特征性的相對穩定的圖譜。其最大的特點就是通過指紋圖譜的特征性,有效鑒別樣品的真偽。目前使用最多的中藥化學指紋圖譜是采用HPLC法[33],可提供大量的信息。符合中藥復雜體系研究的需要。

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