靶向抑制G蛋白偶聯受體激酶2在心力衰竭基因治療中的研究進展

宋衍秋 毛用敏

靶向抑制G蛋白偶聯受體激酶2在心力衰竭基因治療中的研究進展

宋衍秋 毛用敏△

G蛋白偶聯受體激酶2 心力衰竭 受體,腎上腺素能β 基因療法 綜述

心力衰竭是許多器質性心臟疾病發展的終末階段，其發病機制及病理生理過程復雜。傳統的藥物治療雖然能有效緩解心力衰竭的癥狀，降低患者住院率，但其5年病死率仍超過50%[1]。隨著分子生物學的發展及對心血管疾病發病機理認識的逐漸深入，基因治療為心力衰竭提供了一種新的治療途徑。

G蛋白偶聯受體（G protein coupled receptors,GPCRs）是一類具有7個跨膜區蛋白的超家族。βAR是其之一，其可調節心臟對兒茶酚胺類物質的反應。βAR信號在一些心血管疾病中均下降。在心力衰蝎的進展過程中，βAR的密度和反應性嚴重降低，這個過程受G蛋白偶聯受體激酶(G protein coupled receptor kinases,GRKs)的調節。慢性心力衰竭心肌細胞的GRK2也稱為β腎上腺素受體激酶1（β-adrenergic re?ceptor inases 1,βARK1），其活性及表達水平顯著升高，導致βAR通路減敏及心臟功能降低。目前，有研究發現通過基因治療調控GRK2活性可對多種心臟疾病起到良好的治療作用，為心血管疾病的治療開辟了新途徑[2]。本文將GRK2在正常心臟及心力衰竭中的作用機制及其在心力衰竭基因治療研究中的新進展綜述如下。

1 βARs-G蛋白-腺苷酸環化酶信號轉導通路在心臟功能中的作用

目前已發現的GPCRs有300余種。兒茶酚胺類神經遞質腎上腺素和去甲腎上腺素與心臟組織βAR相結合，發揮調節心率、心肌細胞的收縮、分化、增殖和凋亡等作用[3]。人心肌細胞βAR有3個亞型：β1AR、β2AR和β3AR，其中β1AR為優勢型βAR，占總βAR的70%~80%；β2AR次之，約占20%；β3AR呈少量分布[4]。兒茶酚胺類βAR激動劑與βAR結合后，βAR構型改變，使與其偶聯的無活性GDP-GαGβγ中的Gα與GDP解離，Gα隨繼與GTP結合成Gα-GTP成為激活狀態，并與Gβγ亞基分離，繼而激活細胞膜內的腺苷酸環化酶（AC），AC催化ATP生成環腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate,cAMP），cAMP作為細胞內第二信使激活蛋白激酶A（protein kinase A,PKA），PKA可使多種調節蛋白磷酸化，從而調節心肌細胞的正性變時、變力和變傳導效應[5]。Gβγ也可以激活一些下調效應分子，在心臟信號傳導中發揮作用。

在心力衰竭的發展過程中，βAR介導的信號轉導發生著微妙的變化，主要表現為β1AR密度的下調和G蛋白-βAR的失偶聯（脫敏）[3]。心力衰竭發生初期，交感神經系統活性增加，心率加快，心肌收縮力增強，使心排血量在相當時間內維持正常；然而交感神經系統活性長期增強，可產生兒茶酚胺毒性效應。研究發現，高濃度兒茶酚胺可導致GRK2數量或活性的改變，從而造成βAR密度下調和脫敏的發生，推測GRK2在心力衰竭的過程中發揮重要的作用[6]。

2GKR2的生物學功能

GRKs屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，目前已知的哺乳動物有7種GRKs，命名為GRK1~7，其中GRK2在βAR介導的信號轉導途徑中具有重要的作用。GRK2是位于細胞膜上的細胞溶質酶，與活化G蛋白的Gβγ亞單位結合而激活，使活化的βAR跨膜內側的羧基端磷酸化，介導β抑制蛋白與βAR結合，致使βAR與G蛋白解偶聯，阻斷βARs-G蛋白-腺苷酸環化酶信號轉導通路，導致βAR受體密度的降低和脫敏[7]。

心臟βAR介導的信號轉導和其脫敏處于一個動態平衡，以維持正常的心功能。在心力衰竭早期，GRK2的上調可以抵消交感神經系統過度興奮所致的兒茶酚胺毒性效應，此時GRK2的上調可能是心臟的一個保護機制。然而有研究顯示，GRK2過度表達的轉基因小鼠，βAR信號轉導異常，心肌收縮力減弱，呈現慢性心力衰竭的病理生理表現[7]。應用GRK2抑制劑—βARKct或者對小鼠實行GRK2基因敲除均可顯著增加心肌收縮力及心肌纖維對兒茶酚胺等神經遞質的反應性。βARKct同樣可以使轉基因過表達GRK2小鼠心功能及βAR信號轉導得以改善[8]?？梢?，在心力衰竭的發展進程中，GRK2的過度表達已并非心臟的保護機制，很可能是促進心力衰竭進展的一個重要因素。

3 靶向抑制GRK2在心力衰竭基因治療中的新進展

20世紀90年代以來，針對βAR信號轉導途徑展開的基因治療一直是心力衰竭的研究熱點。Drazner等[9]利用腺病毒載體構建了攜帶GRK2抑制劑—βARKct的重組腺病毒Ad-βARKct，感染成年兔左室肌細胞，可顯著改善心肌細胞βAR的信號轉導。Williams等[10]發現Ad-βARKct體外感染人心力衰竭心肌細胞，可使心肌細胞收縮力及βAR反應性均增強，為干預GRK2活性的基因治療應用于人心力衰竭的治療提供了可行性依據。此后，抑制GRK2基因治療的在體實驗得以開展。White等[11]首次利用腺病毒載體將βARKct經冠脈導入心肌梗死兔體內，3周后，實驗兔心臟收縮功能改善，βAR信號轉導功能得以恢復，并且能夠預防左心室重構。該研究首次證實了βARKct在心力衰竭活體模型中的治療作用。Shah等[12]制備兔心肌梗死后心力衰竭模型，經導管冠脈給予Ad-βARKct，1周后發現βARKct在心臟組織得到有效表達，左室收縮末壓降低，左心功能增強，βAR脫敏現象逆轉。βARKct同樣可以改善肺動脈高壓致右心衰兔模型右心室功能，并降低動物致死率[13]。此外，Tevaearai等[14]也證實了βARKct對于急性缺血性心肌損傷的治療作用，使左室心功能及βAR信號轉導功能得以改善。上述研究提示，GRK2的靶向抑制對心力衰竭的治療可能具有重要的作用。

雖然腺病毒載體具有低毒、高效、大容量等諸多優點，但由于其在體內表達時間相對較短，只能對GRK2的靶向抑制治療作用短期觀察，特別限制了其在慢性心力衰竭方面的研究。Rengo等[15]利用腺相關病毒載體在體內表達外源基因時間長的優點，構建重組6型腺相關病毒AAV6-βARKct，并觀察其對慢性心力衰竭大鼠的治療作用，結果顯示實驗大鼠經冷凍左室游離壁12周后，成功制備了心肌梗死后慢性心力衰竭模型。直接局部心肌注射AAV6-βARKct基因治療12周后，發現βARKct在心肌組織中表達穩定，超聲心動圖及血液動力學檢測表明心功能顯著改善；心肌細胞內cAMP水平升高，心肌細胞膜βAR密度增加，心肌細胞內GRK2水平顯著降低，大鼠心臟指數顯著降低，心肌組織I型膠原、轉化生長因子β1、A型利鈉肽、B型利鈉肽表達降低；此外，大鼠血漿腎上腺素、去甲腎上腺素及醛固酮水平也均下降。該研究明確了長期βARKct治療對慢性心力衰竭有顯著的治療作用，同時提示長時間抑制GRK2可改善慢性心力衰竭的心室重構。

心力衰竭一個顯著的病理生理學特征是交感神經系統活性增高，血循環兒茶酚胺類物質濃度升高，而高濃度兒茶酚胺類物質又可引起心臟毒性效應，在心力衰竭的發展過程中具有重要作用，機體血循環兒茶酚胺類物質主要由交感神經系統末梢和腎上腺髓質分泌[16]。研究發現，正常大鼠腎上腺髓質過度表達GRK2，可導致兒茶酚胺類物質濃度緩慢升高[17]。Ad-βARKct特異性感染大鼠腎上腺髓質，降低GRK2表達后，血清兒茶酚胺類物質顯著降低[18]。Ad-βARKct特異性感染心肌梗死后心力衰竭大鼠腎上腺髓質，降低腎上腺髓質GRK2表達水平，可以顯著降低大鼠體內兒茶酚胺類物質水平，大鼠心功能改善[19]。特異敲除腎上腺嗜鉻細胞GRK2基因小鼠，心梗后4周血清腎上腺素和去甲腎上腺素水平均降低，心功能提高，心臟βAR信號轉導改善[20]。此外，研究發現腎上腺GRK2與位于腎上腺皮質的作用因子β抑制蛋白-1相互作用，影響腎上腺皮質激素醛固酮的分泌；心肌梗死后心力衰竭大鼠腎上腺GRK2過度表達，血清醛固酮水平增加，而醛固酮在慢性心力衰竭的進展過程中也具有重要作用[21]。上述實驗表明，腎上腺靶向抑制GRK2，可降低交感神經系統活性及醛固酮的分泌，可能成為預防和治療心力衰竭的一個新靶點。

目前基因治療的發展仍然面臨著一些亟待解決的問題，如載體的安全性、轉染效率及目的基因表達等。但隨著對GRK2研究的逐漸深入，以抑制其活性為靶點的基因治療，仍具有十分重要的理論和現實意義，可能成為預防并治療心力衰竭的一個全新途徑。

[1]Braunwald E,Bristow MR.Congestive heart failure:fifty years of progress[J].Circulation,2000,102(20 Suppl4):IV14-23.

[2]Jessup M,Greenberg B,Mancini D,et al.Calcium Upregulation by Percutaneous Administration of Gene Therapy in Cardiac Disease(CUPID):a phase 2 trial of intracoronary gene therapy of sarcoplas?mic reticulum Ca2+-ATPase in patients with advanced heart failure[J].Cireulation,2011,124(3):304-313.

[3]Hamdani N,Linke WA.Alteration of the beta-adrenergic signaling pathway in human heart failure[J].Curr Pharm Biotechnol,2012,Jan 20(Epub ahend of print).

[4]Fu Y,Xiao H,Zhang Y.Beta-adrenoceptor signaling pathways me?diate cardiac pathological remodeling[J].Front Biosci(Elite Ed),2012,4:1625-1637.

[5]Nagatomo Y,Yoshikawa T,Kohno T,et al.A pilot study on the role of autoantibody targeting the beta1-adrenergic receptor in the re?sponse to beta-blocker therapy for congestive heart failure[J].J Card Fail,2009,15(3):224-232.

[6]Rengo G,Lymperopoulos A,Leosco D,et al.GRK2 as a novel gene therapy target in heart failure[J].J Mol Cell Cardiol,2011,50(5):785-792.

[7]Evron T,Daigle TL,Caron MG.GRK2:multiple roles beyond G pro?tein-coupled receptor desensitization[J].Trends Pharmacol Sci,2012,33(3):154-164.

[8]Lymperopoulos A,Rengo G,Koch WJ.GRK2 inhibition in heart failure:something old,something new[J].Curr Pharm Des,2012,18(2):186-191.

[9]Drazner MH,Peppel KC,Dyer S,et al.Potentiation of beta-adrener?gic signaling by adenoviral-mediated gene transfer in adult rabbit ventricular myocytes[J].J Clin Invest,1997,99(2):288-296.

[10]Williams ML,Hata JA,Schroder J,et al.Targeted beta-adrenergic receptor kinase(betaARK1)inhibition by gene transfer in failing human hearts[J].Circulation,2004,109(13):1590-1593.

[11]White DC,Hata JA,Shah AS,et al.Preservation of myocardial be?ta-adrenergic receptor signaling delays the development of heart failure after myocardial infarction[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(10):5428-5433.

[12]Shah AS,White DC,Emani S,et al.In vivo ventricular gene deliv?ery of a beta-adrenergic receptor kinase inhibitor to the failing heart reverses cardiac dysfunction[J].Circulation,2001,103(9):1311-1316.

[13]Emani SM,Shah AS,Bowman MK,et al.Right ventricular targeted gene transfer of a beta-adrenergic receptor kinase inhibitor im?proves ventricular performance after pulmonary artery banding[J].J Thorac Cardiovasc Surg,2004,127(3):787-793.

[14]Tevaearai HT,Walton GB,Keys JR,et al.Acute ischemic cardiac dysfunction is attenuated via gene transfer of a peptide inhibitor of the beta-adrenergic receptor kinase(betaARK1)[J].J Gene Med,2005,7(9):1172-1177.

[15]Rengo G,Lymperopoulos A,Zincarelli C,et al.Myocardial ade?no-associated virus serotype 6-betaARKct gene therapy improves cardiac function and normalizes the neurohormonal axis in chronic heart failure[J].Circulation,2009,119(1):89-98.

[16]Lymperopoulos A,Rengo G,Koch WJ.Adrenal adrenoceptors in heart failure:fine-tuning cardiac stimulation[J].Trends Mol Med,2007,13(12):503-511.

[17]Rengo G,Leosco D,Zincarelli C.Adrenal GRK2 lowering is an un?derlying mechanism for the beneficial sympathetic effects of exer?cise training in heart failure[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2010,298(6):H2032-2038.

[18]Lymperopoulos A,Rengo G,Zincarelli C,et al.Modulation of adre?nal catecholamine secretion by in vivo gene transfer and manipula?tion of G protein-coupled receptor kinase-2 activity[J].Mol Ther,2008,16(2):302-307.

[19]Lymperopoulos A,Rengo G,Funakoshi H,et al.Adrenal GRK2 up?regulation mediates sympathetic overdrive in heart failure[J].Nat Med,2007,13(3):315-323.

[20]Lymperopoulos A,Rengo G,Gao E,et al.Reduction of sympathetic activity via adrenal-targeted GRK2 gene deletion attenuates heart failure progression and improves cardiac function after myocardial infarction[J].J Biol Chem,2010,285(21):16378-16386.

[21]Lymperopoulos A,Rengo G,Zincarelli C,et al.Adrenal beta-arres?tin 1 inhibition in vivo attenuates post-myocardial infarction pro?gression to heart failure and adverse remodeling via reduction of cir?culating aldosterone levels[J].J Am Coll Cardiol,2011,57(3):356-365.

300050 天津市胸科醫院，天津市心血管病研究所△審校者

（2011-10-24收稿 2012-03-06修回）

（本文編輯 閆娟）