鈣網蛋白與抗腫瘤免疫的相關性研究新進展

熊輝強 綜述，李 黎，張少容審校

（南昌大學第二附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科，南昌 330006）

有研究發現，多種腫瘤細胞表面攜帶了自我毀滅的種子——鈣網蛋白（calreticulin，CRT），其可發送信號招募吞噬細胞吞噬并消化這些腫瘤細胞，達到徹底清除腫瘤細胞的功效。CRT可作為某些腫瘤細胞表面一種有效的促吞噬信號，通過結合吞噬細胞表面的低密度脂蛋白－相關蛋白受體（lowdensity lipoprotein－related protein，LRP）使腫瘤細胞被吞噬，引起機體的抗腫瘤免疫反應［1］。CRT具有多種生物學功能，其表達調控機制復雜，在抗腫瘤免疫過程中發揮重要作用，有望成為抗腫瘤免疫治療新途徑。現將CRT生物學功能、表達、調控及其與抗腫瘤免疫的相關性研究新進展作一綜述。

1 CRT的生物學功能及其表達

CRT是一種相對分子質量為4.6×104DaCa2＋結合蛋白，主要位于非肌細胞粗面內質網和肌質網中，由人19號染色體上單一基因編碼，包含9個外顯子，具有高度的進化保守性［2］。CRT具有多種功能，參與伴侶分子活性及細胞內Ca2＋環境平衡的調節，細胞間黏附信號的調控，內質網中折疊和低聚反應過程中黏蛋白的合成，以及抑制血管生成和腫瘤細胞生長［3－4］。此外，CRT在主要組織相容性復合體I（major histocompatibility complex I，MHC－I）的組合、類固醇介導的基因的調節以及Zn2＋的結合和儲存中起重要作用［5］。細胞核中的CRT能調節核蛋白遷移和影響信號經由核甾體激素受體和整聯蛋白［6］。當用蒽環類抗生素、奧沙利鉑、放射治療及缺氧等處理，細胞表面的CRT暴露，并成為一種“來吃我”信號，招募樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）和巨噬細胞，導致免疫反應［7－8］。CRT 還與腫瘤的發生有關，通過增加細胞與細胞間、細胞與基質間的黏附能力［9］或者減少 MHC－I類抗原提呈發揮作用［10］。

CRT的表達已經在多種腫瘤中被發現，例如黑色素瘤、肝癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌及乳腺癌［11－14］等。Chao等［15］研究表明，CRT主要表達于惡性腫瘤細胞和凋亡細胞的表面，前者主要包括血液系統惡性腫瘤中的急性髓細胞白血病（acute myelocytic leukemia，AML）、急性淋巴細胞性白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）、慢性髓細胞白血病（chronic myelognous leukemia，CML）和非霍奇金淋巴瘤（non－Hodgkin’s lymphoma，NHL），以及實體瘤中的惡性膠質瘤、膀胱癌和卵巢癌等，但是在對應的正常細胞中卻很少表達。以往的研究還表明CRT亦存在于有活性的外周血T細胞和循環中的中性粒細胞［16］。

2 CRT表達的調控機制

CRT正常位于細胞的內質網腔，其在細胞中發揮促吞噬信號功能需要經過系列的途徑遷移至胞膜，并與ERp57以分子絡合物的形式共同表達于細胞膜表面發揮作用。CRT暴露遷移途徑復雜，涉及的調控機制：內質網（endoplasmic reticu－lum，ER）應激性原理、細胞凋亡機制（caspase－8及其底物BAP31、Bax、Bak）、蛋白從ER至高爾基體的轉運，以及 N－甲基馬來酞胺敏感因子附著蛋白受體（soluble NSF attachment protein receptors，SNAREs）相關的胞吐作用等。

2.1 ER應激性原理 在Kepp等［17］的研究中，用蒽環類抗生素、奧沙利鉑（抗腫瘤藥）或者電離照射治療一段時間的鼠CT26細胞、人類HCT－16結腸癌細胞，以及人類Hela頸部癌細胞和鼠胚胎性成纖維細胞，發現CRT能夠暴露于這些細胞的表面，該作用是伴隨ER超微結構的破壞以及ER應激反應信號的產生，使內質網固定激酶PERK激活，真核起始因子（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）則變成了磷酸化的絲氨酸－51，并轉化成一種鳥嘌呤核苷酸轉換因子eIF2β的抑制劑，從而影響CRT蛋白合成。同樣地，敲除PERK也能廢除CRT暴露。因此，CRT的暴露需要PERK介導的eIF2α磷酸化作用。而Novoa等［18］研究表明，ER應激還能產生一種由2個亞單位構成的GADD34抑制劑，通過與蛋白磷酸酶－1（PP1）的相互作用來介導eIF2α磷酸化過程，影響CRT的暴露途徑。

2.2 細胞凋亡機制 有研究發現，細胞表面CRT的表達能被一般的半胱天冬酶（caspase）抑制劑所抑制，例如化學合成的假底物Z－VAD－fmk或者桿狀病毒編碼的p35蛋白［19］。相應地，敲除PERK能廢除由蒽環類抗生素誘導的caspase－8的蛋白水解成熟過程。敲除caspase－8基因（而不是caspase－3，7，12）能廢除CRT的暴露。然而在caspase－8－／－MEFs顯示出正常的PERK介導的eIF2α磷酸化，表明PERK位于caspase－8的上游區。caspase－8需要降解其底物BAP31發揮作用，BAP31是一種 Bcl－2結合蛋白［20］。當用無裂解的 D164A／D238ABAP31突變體轉染Hela癌細胞后丟失了CRT遷移能力，敲除BAP31類似于廢除CRT暴露。Bcl－2是細胞凋亡的一個顯著性的抑制劑，能阻礙促吞噬因子的Bax和Bak的活性［21］。在MEFs中敲除Bax或者Bak中的任何一個，或者在Hela和CT26細胞中敲除Bax、Bak蛋白均能廢除CRT的暴露。由此可見，caspase－8及其裂解底物BAP31、Bax、Bak都是CRT暴露所必須的。

2.3 蛋白的轉運與胞吐作用 CRT的暴露需經過ER至高爾基體轉運的過程，CRT蛋白以小囊泡形式從高爾基體發出，與細胞膜融合，并以SNAREs依賴的胞吐方式分泌。布雷菲德菌素A（brefeldin A），一種順行蛋白從ER至高爾基體轉運的抑制劑，能阻斷由蒽環類抗生素誘導的CRT暴露，敲除SNAREs同樣能抑制CRT暴露。表明蛋白的轉運過程和胞吐作用對于CRT釋放起重要作用。

2.4 ERp57 ERp57是一種固著的二硫化物異構酶，能在ER內相互干擾CRT，共同轉移CRT至細胞表面，應對免疫原性的細胞死亡誘導。敲除了ERp57能完全廢除CRT暴露，反之亦然，敲除CRT也能抑制ERp57暴露。用特異性ERp57逆轉錄RNA干擾的腫瘤細胞可減少ERp57表達，再用蒽環類藥物處理只表現正常的凋亡，ERp57低表達的腫瘤細胞不能引起CRT的移位。表明CRT與ERp57的相互作用是共遷移到細胞表面所必需的。Obeid［22］研究顯示，CRT的表達受到ERp57表達的控制，敲掉ERp57可抑制CRT的表達并被樹突狀細胞吞噬，從而消除了免疫原性，敲掉CRT或缺乏CRT可消除ERp57的表達，給予重組ERp57并不能恢復腫瘤細胞的免疫原性（與v重組CRT不同），ERp57通過控制CRT的表達來控制腫瘤細胞的免疫原性。

3 CRT與抗腫瘤免疫

有效地抗腫瘤治療不單是殺死腫瘤細胞，更重要的是建立抗腫瘤免疫反應。腫瘤細胞表面CRT的表達能招募DCs和吞噬細胞，導致機體的抗腫瘤免疫反應。Xu等［23］研究發現，CRT不僅能夠結合E7有效地促進DCs提呈E7抗原、誘導抗原特異性CD8－T細胞，還能促使白細胞介素（IL）－2、IFN－γ分泌，進而活化吞噬細胞、自然殺傷（NK）細胞，促使CTL增殖及抗腫瘤免疫作用。腫瘤細胞可以通過多種機制逃避免疫攻擊而抵抗機體的免疫清除。最近有研究表明，腫瘤細胞通過下調促吞噬信號的CRT表達是細胞逃避吞噬反應的另外一種機制，通過這種機制腫瘤細胞可以逃避免疫監視。若能對某些因低水平表達CRT引起的腫瘤免疫逃避反應增加其細胞表面CRT的表達則能重新引起機體的抗腫瘤免疫，使腫瘤細胞被清除。Panaretakis等［24］研究發現，用蒽環類抗生素——米托蒽醌（MTX）治療高水平表達CRT／ERp57的鼠CT26癌細胞移植瘤時其能被治愈，而移植低水平表達CRT／ERp57的CT26癌細胞的小鼠移植瘤卻未能被治愈。對于后者，當其瘤體內注射重組體CRT蛋白時又能使小鼠被治愈。因為注射重組體CRT蛋白后，其能吸附至腫瘤細胞表面，相當于增加了腫瘤細胞表面CRT的表達。為了證明細胞表面增加CRT表達能否促使吞噬作用進行了體外吞噬實驗，在培養的骨髓細胞（normal bone marrow，NBM）中添加外源性重組體CRT蛋白，與對照組比較，用外源性CRT培養的NBM能夠促使巨噬細胞的吞噬作用。這些結果表明機體的抗腫瘤免疫功能的發揮需要細胞表面CRT的存在。

Chao等［15］研究表明，多數腫瘤細胞“促吞噬信號”CRT的表達常伴有“抗吞噬信號”CD47的表達，以此來防護CRT介導的吞噬作用。當CRT－阻斷肽阻斷靶細胞表面CRT與吞噬細胞表面的受體LRP間的相互作用，吞噬活性被完全廢除，從而引起腫瘤的免疫逃避。同樣地，若能下調“抗吞噬信號”CD47的表達水平，此時相當于上調了CRT的水平，則同樣能引起吞噬細胞對腫瘤的吞噬作用。為了證明這一假說，他們用慢病毒－shRNAs敲除Raji細胞（一種Burkitts NHL細胞系）中CD47基因的表達，細胞表面CRT的表達沒有受shRNA介導的CD47基因敲除的影響，當其置于人類吞噬細胞中一起培養，與對照組比較，Raji細胞能大量被人類吞噬細胞吞噬。當用抗－CD47單克隆抗體結合腫瘤細胞表面的CD47分子，同樣能使腫瘤細胞中的抗吞噬信號（CD47）被抑制，暴露出促吞噬信號（CRT），促使了吞噬細胞的吞噬作用。從上述研究可見，腫瘤細胞表面CRT和CD47的平衡表達，對機體的抗腫瘤免疫起重要的作用。CRT作為多種人類癌癥組織中的主要促吞噬信號，為用重組體CRT及沉默CD47基因對腫瘤的靶向治療提供依據。

Peng等［25］研究表明，結腸癌中CRT的表達和CD45RO＋T細胞的浸潤密切相關，與CD3＋T細胞的浸潤及患者的其他參數（年齡、性別、腫瘤位置）無相關性。CD45RO＋T細胞為一種記憶性T細胞，其表面黏附分子表達強，能直接向抗原部位移動，當再次抗原刺激時，即刻發生強烈的免疫反應［26］。CD45RO＋T細胞在結直腸癌組織中的浸潤，能減緩腫瘤的進展［27］。CRT的抗腫瘤免疫功能可能與刺激CD45RO＋T細胞的增殖、浸潤有關。尚需更多的研究進一步證實并發現其相關作用機制。

4 展 望

腫瘤發生的一個重要因素就是突變的腫瘤細胞能夠下調一些分子的表達來逃避免疫反應，而這些分子在細胞識別和吞噬過程中起重要的作用［28］。期望通過改變細胞表面相關分子的表達來恢復或者刺激機體的免疫反應，以此來完成一種有效的腫瘤預防和治療。CRT作為某些惡性腫瘤組織中的主要“促吞噬信號”，其在腫瘤細胞中的移位暴露引發了免疫反應，為抗腫瘤傳統治療方法聯合免疫治療提供新的契機。CRT的促吞噬作用能被細胞表面“抗吞噬信號”的CD47分子所抵抗，敲除CD47基因或者用抗－CD47單克隆抗體療法同樣可以達到治療效果，表明腫瘤免疫過程中促吞噬和抗吞噬信號平衡表達的重要性。其他惡性腫瘤組織中是否均存在CRT的表達，其如何與CD47共同作用于腫瘤的發生、發展，以及其相關作用機制，這些都亟待進一步的深入研究。

［1］ Gardai SJ，McPhillips KA，Frasch SC，et al.Cell－surface calreticulin initiates clearance of viable or apoptotic cells through trans－activation of LRP on the phagocyte［J］.Cell，2005，123（2）：321－334.

［2］ Ni M，Lee AS.ER chaperones in mammalian development and human diseases［J］.FEBS Lett，2007，581（19）：3641－3651.

［3］ Garg AD，Nowis D，Golab J，et al.Immunogenic cell death，DAMPs and anticancer therapeutics：an emerging amalgamation［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1805（1）：53－71.

［4］ Villagomez M，Szabo E，Podcheko A，et al.Calreticulin and focal－contact－dependent adhesion［J］.Biochem Cell Biol，2009，87（4）：545－556.

［5］ Solheim JC，Class I.MHC molecules：assembly and antigen presentation［J］.Immunol Rev，1999，172：11－19.

［6］ Mesaeli N，Phillipson C.Impaired p53expression，function，and nuclear localization in calreticulin－deficient cells［J］.Mol Biol Cell，2004，15（4）：1862－1870.

［7］ Tesniere A，Schlemmer F，Boige V，et al.Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin［J］.Oncogene，2010，29（4）：482－491.

［8］ Panaretakis T，Kepp O，Brockmeier U，et al.Mechanisms of pre－apoptotic calreticulin exposure in immunogenic cell death［J］.EMBO J，2009，28（5）：578－590.

［9］ Alur M，Nguyen MM，Eggener SE，et al.Suppressive roles of calreticulin in prostate cancer growth and metastasis［J］.Ame J Pathol，2009，175（2）：882－890.

［10］Howe C，Garstka M，Al－Balushi M，et al.Calreticulin－de－pendent recycling in the early secretory pathway mediates optimal peptide loading of MHC class I molecules［J］.EMBO J，2009，28（23）：3730－3744.

［11］Kageyama S，Isono T，Matsuda S，et al.Urinary calreticulin in the diagnosis of bladder urothelial carcinoma［J］.Int J Urol，2009，16（5）：481－486.

［12］Seliger B，Stoehr R，Handke D，et al.Association of HLA class I antigen abnormalities with disease progression and early recurrence in prostate cancer［J］.Cancer Immunol Immunother，2010，59（4）：529－540.

［13］Eric，Juranic Z，Milovanovic Z，et al.Effects of humoral immunity and calreticulin overexpression on postoperative course in breast cancer［J］.Pathol Oncol Res，2009，15（1）：89－90.

［14］Bergner A，Kellner J，Tufman A，et al.Endoplasmic reti culum Ca2＋－homeostasis is altered in small and non－small cell lung cancer cell lines［J］.J Exp Clin Cancer Res，2009，28（1）：25－31.

［15］Chao MP，Jaiswal S，Weissman－Tsukamoto R，et al.Calreticulin is the dominant pro－phagocytic signal on multiple human cancers and is counterbalanced by CD47［J］.Sci Transl Med，2010，2（63）：1－9.

［16］Ghiran I，Klickstein LB，Nicholson－Weller A.Calreticulin is at the surface of circulating neutrophils and uses CD59 as an adaptor molecule［J］.J Biol Chem，2003，278（23）：21024－21031.

［17］Kepp O，Senovilla L，Galluzzi L，et al.Viral subversion of immunogenic cell death［J］.Cell Cycle，2009，8（6）：860－869.

［18］Novoa I，Zeng H，Harding HP，et al.Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34－mediated dephosphorylation of eIF2alpha［J］.J Cell Biol，2001，153（5）：1011－1022.

［19］Obeid M，Tesniere A，Ghiringhelli F，et al.Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death［J］.Nat Med，2007，13（1）：54－61.

［20］Nq FW，Nquyen M，Kwan T，et al.p28Bap31，a Bcl－2／Bcl－XL－and procaspase－8－associated protein in the endoplasmic reticulum［J］.J Cell Biol 1997，139（2）：327－338.

［21］Kroemer G，Galluzzi L，Brenner C.Mitochondrial membrane permeabilization in cell death［J］.Physiol Rev，2007，87（1）：99－163.

［22］Obeid M.ERp57membrane translocation dictates the immunogenicity of tumor cell death by controlling the membrane translocation of calreiculin［J］.J Immunol，2008，181（4）：2533－2543.

［23］Xu Y，Cheng H，Zhao KJ，et al.HPV DNA vaccines expressing recombinant CRT／HPV 6bE7fusion protein inhibit tumor growth and angiogenic activity［J］.Bing Du Xue Bao，2007，23（6）：466－470.

［24］Panaretakis T，Joza N，Modjtahedi N，et al.The co－translocation of ERp57and calreticulin determines the immunogenicity of cell death［J］.Cell Death Differ，2008，15（9）：1499－1509.

［25］Peng RQ，Chen YB，Ding Y，et al.Expression of calreticulin is associated with infltration of T－cells in stage ⅢB colon cancer［J］.World J Gastroenterol，2010，16（19）：2428－2434.

［26］肖剛，趙剛，許曉東，等.結腸癌患者外周血中CD4＋CD45RA＋T和CD4＋CD45RO＋T細胞的變化及其意義［J］.中華腫瘤雜志，2003，25（4）：362－364.

［27］Pagès F，Kirilovsky A，Mlecnik B，et al.In situ cytotoxic and memory T cells predict outcome in patients with early－stage colorectal cancer［J］.J Clin Oncol，2009，27（35）：5944－5951.

［28］Kepp O，Tesniere A，Schlemmer F，et al.Immunogenic cell death modalities and their impact on cancer treatment［J］.Apoptosis，2009，14（4）：364－375.