煙草突變體篩選與鑒定方法篇：2.煙草抗主要病蟲害突變體的篩選與鑒定

申莉莉

（中國農業科學院煙草研究所，青島 266101）

參照煙草品種抗病性鑒定標準GB/T 23224—2008，煙草基因組計劃重大專項“煙草突變體創制、篩選與分析”建立了煙草抗病毒病、青枯病、黑脛病、赤星病、煙蚜的高通量篩選方法，將全面開展煙草抗主要病蟲害突變體的大量篩選與鑒定工作。

1 抗主要病蟲害突變體的高通量篩選

煙草品種抗病蟲鑒定多采用溫室苗期人工接種鑒定，在品種推廣前再經大田成株期鑒定。面對龐大的突變群體，選擇一種快速、準確的篩選方法是獲得有益抗性突變體的核心。

1.1 病毒病

煙草病毒病抗性篩選主要采用田間病圃系統調查和溫室苗期接種兩種方法。通過對常規汁液摩擦接種、衣刷快速摩擦接種、噴槍接種和剪葉接種以及逐株調查病情、目測病情、ELISA、檢測試紙條和RT-PCR等病毒檢測方法比較發現，刷接目測病情法省時省力且能準確反應品種抗性。即用塑料衣刷蘸取病毒汁液輕輕摩擦葉片接種，根據每批次抗感品種的病情劃分病害嚴重度，目測每個突變材料（盤）病情。

1.2 青枯病

煙草青枯病抗性篩選有田間病圃篩選和室內苗期接種篩選。苗期篩選接種方法主要有傷根灌菌法、菌液浸根法、莖部穿刺法、葉片注射法。煙草青枯病菌是從根部傷口侵入，引起微管束變褐，植株萎蔫，為典型的微管束病害。經剪葉接種和莖枝菌液浸泡接種研究表明，莖枝菌液浸泡法發病快，幼苗抗病性與田間抗性一致，易操作。即用手術刀垂直切取帶有 3～4片展葉的主莖，標記、浸于盛有青枯病菌菌液的容器內5 d，逐莖調查病情。根據抗感品種發病期和病情，劃分突變材料病害嚴重度。

1.3 黑脛病

煙草黑脛病抗病性篩選有田間病圃篩選、室內接種篩選和離體葉片接種篩選3種方法；苗期篩選又分為根接種和莖接種，根接種的接種體有孢子懸浮液和菌谷兩種。用煙草黑脛病菌粗毒素浸種，經發芽率、根冠細胞、葉片和電解質滲透等測定法比較發現，經粗毒素浸種，種子發芽率與抗病性呈正相關，且與大田抗性表現一致。試驗占空間少，周期短（15 d）。即用無菌毒素液浸泡種子4～8 h，選取飽滿的種子置于無菌的水瓊脂培養皿平板上保濕培養，于25 ℃培養箱中促其萌發，測定發芽率。

1.4 赤星病

煙草赤星病抗性篩選有大田篩選、溫室篩選、離體葉片篩選和毒素篩選。根據毒素作用部位的不同，又分為離體葉片法、幼苗浸根法、種子根處理法等。而離體葉片法又分為懸滴法、噴霧法和針刺法[1]。煙草不同品種對毒素的敏感程度與對病原菌的敏感程度密切相關，經不同抗感品種幼苗用赤星病菌毒素浸根研究發現，根長與抗病性呈正相關，與田間成株期抗性基本一致。即將每個突變材料2～3真葉期幼苗10～15株放入盛有赤星病菌無菌粗毒素稀釋液的容器中浸根，25 ℃培養6 d，測量根長。

1.5 煙蚜

煙蚜抗性篩選有常規苗期篩選和大田成株期篩選，也可根據植株受害癥狀等感官特征判定抗性。不同抗感品種苗期接蚜，通過蚜量比值法和模糊識別法研究顯示，蚜量比值法能客觀地比較所參試材料的抗感差別，消除蚜蟲不均勻分布帶來的誤差。溫室苗期蚜量比值法，即溫室育苗，再自然感蚜或接蚜，于煙蚜盛發期逐株調查煙蚜數量。根據蚜量比值劃分抗性，其中蚜量比值＝某突變材料的蚜量/全部觀測材料的平均蚜量。

2 抗主要病蟲害突變體的鑒定

煙草植株的各種性狀均受染色體上的基因控制。基因突變可通過田間表型、細胞組織學、生物化學、蛋白質組學呈現，最終經基因定位鑒定突變。

對上述通過正篩選體系獲得的抗病蟲突變材料，經連續2年種植鑒定，剔除環境影響和差異不明顯株系，獲得可遺傳變異的突變體，以野生型中煙100及其他抗感品種為對照，進行鑒定。

2.1 田間表型鑒定

結合田間（自然）和溫室（人工接種），對抗病蟲突變材料進行至少 2年以上（多點）的表型抗性鑒定。

2.2 細胞組織學鑒定

抗病蟲突變材料經自然感病蟲或人工接種，用電鏡技術觀察其組織病理學特征，進行細胞組織學鑒定[2]。

2.3 生物化學鑒定

通過自然感病蟲或人工接種，抗病突變材料用氣相色譜（GC）檢測水楊酸（SA，信號調節因子）水平，抗蟲突變體用 GC檢測茉莉酸（JA，信號調節因子）或煙葉分泌物中 α,β-黑松三烯二醇（DVTS，吸引煙蚜產卵）水平，進行生物化學鑒定[3]。

2.4 蛋白質組學鑒定

煙草品種的抗病蟲性是一個復雜的信號轉達和生理調控網絡，以蛋白質差異表達的形式反饋[2]。借助蛋白質雙向電泳聯用質譜技術，鑒定抗病蟲突變材料與野生型及其他抗感品種的蛋白質組表達差異。

2.5 突變基因鑒定

2.5.1 突變體的遺傳分析 突變體與野生型雜交，簽定F1抗感性以確定顯隱性突變，分析F2抗感分離規律，確定突變基因數目[4-5]。質量性狀突變符合孟德爾3:1遺傳分離規律，多由一對（單）隱性核基因控制。數量性狀突變為多基因控制，抗性突變呈連續累加效應。

2.5.2 突變基因定位 構建 F2定位群體，利用 RFLP、SSR、RAPD、SNP等分子標記和混合群體分組分析法（BSA），對F2分離群體和抗病蟲突變體的目標基因（抗病蟲）進行連鎖分析，篩選出與目標基因緊密連鎖的分子標記。根據F2定位群體的表型和分子標記的分離數據構建目標基因所在區域的分子標記連鎖圖[6-8]。

在連鎖的分子標記附近設計新的分子標記，用高通量DNA提取方法提取大批F2遺傳群體中的突變體單株DNA，對這些植株進行基因型分析，通過遺傳作圖、篩選基因組文庫、染色體步移等獲得突變基因[9]。

2.5.3 突變基因功能互補驗證 以野生型中煙100和突變體為材料，經等位基因敲除和過表達技術，觀察抗病蟲突變性狀變化，最終確定某一抗病蟲突變體。

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