類鼻疽伯克霍爾德菌致病機(jī)制的分子與細(xì)胞基礎(chǔ)

曹旺斌，賀 英

(河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島，066600)

類鼻疽是類鼻疽伯克霍爾德菌，是廣泛分布于熱帶和亞熱帶泥土中的腐生菌，農(nóng)民在田間勞作的過程中通過皮膚粘膜感染引起類鼻疽病(Melioidosis)。類鼻疽伯克霍爾德菌為革蘭陰性、有運(yùn)動(dòng)性的短桿菌。1911年，Whitmore從仰光38例類似鼻疽的病人中分離獲得，命名為類鼻疽桿菌(文章分別發(fā)表在1912和1913年)，以后將其歸入假單胞菌屬(Pseudomonas)。20世紀(jì)90年代初日本學(xué)者將該菌重新分類，將原假單胞菌屬中的DNA群Ⅱ中的幾個(gè)種列入1個(gè)新屬伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)［1，2］。

類鼻疽伯克霍爾德菌致病范圍廣，人和動(dòng)物可以通過接觸環(huán)境中的病原菌，經(jīng)由攝取、或吸入、或開放的傷口、或皮膚擦傷而感染。能感染的動(dòng)物包括海洋動(dòng)物在內(nèi)的哺乳動(dòng)物以及某些鳥類，與人類有密切關(guān)系的動(dòng)物如馬、牛、羊、豬、犬和貓均有感染報(bào)道。本病潛伏期一般為3～5 d，但也有感染后數(shù)月、數(shù)年，甚至有長(zhǎng)達(dá)62年后發(fā)病，即所謂“潛伏型類鼻疽”，此類病例常因外傷或其他疾病而誘發(fā)。臨床表現(xiàn)復(fù)雜，有急性敗血癥者常伴多處化膿性損害，慢性者類似空洞型肺結(jié)核表現(xiàn)。感染后病變是肺出血、肝脾腫大，有干酪樣壞死病灶，雄性動(dòng)物睪丸腫脹。病情一般較為嚴(yán)重，如不及時(shí)治療，病死率甚高。

類鼻疽伯克霍爾德菌和所有土壤桿菌一樣，很難殺死，能在三蒸水中存活數(shù)年。該菌能夠抑制補(bǔ)體、溶酶體保護(hù)機(jī)制、陽(yáng)離子肽，它還能產(chǎn)生蛋白酶、脂酶、卵磷脂酵素、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、溶血素、細(xì)胞毒素胞外脂類和至少一種含鐵細(xì)胞。類鼻疽的死亡率高達(dá)39．5%，不治療的敗血癥死亡率達(dá)80%以上。

本研究從影響細(xì)菌致病性的毒力因子和細(xì)菌與宿主之間的互作兩個(gè)方面綜述類鼻疽伯克霍爾德菌的致病機(jī)理，為該菌的有效控制提供可能的機(jī)制。

1 細(xì)菌的毒力因子

類鼻疽伯克霍爾德菌的毒力由細(xì)胞結(jié)合性和分泌性兩大類物質(zhì)因素構(gòu)成。一般而言，細(xì)胞結(jié)合性物質(zhì)是防御性物質(zhì)，使得細(xì)菌本身免受特異性和非特異性免疫因子的殺滅，而分泌性物質(zhì)直接引起組織器官的病理變化。類鼻疽伯克霍爾德菌能夠產(chǎn)生許多與毒力相關(guān)的分泌性物質(zhì)，如蛋白酶、脂酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和溶血素等，其中一些毒力因子也與免疫逃避機(jī)制有關(guān)。與其他革蘭陰性菌相比，對(duì)該菌的毒力因子作用機(jī)制缺乏深入地研究。有研究發(fā)現(xiàn)，Ⅲ型分泌系統(tǒng)和群感知系統(tǒng)與該病原菌的毒力密切相關(guān)。由于基因的水平轉(zhuǎn)移或缺失，不同地區(qū)的分離株在基因組、轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)組均有很大差異，表現(xiàn)出了遺傳學(xué)上的多樣性。

1．1 Ⅲ型分泌系統(tǒng)

新近的研究表明，Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)是引起革蘭陰性菌致病性的重要毒力因子［3～6］。研究發(fā)現(xiàn)，類鼻疽伯克霍爾德菌存在3個(gè)Ⅲ型分泌系統(tǒng)，其中T3SS1(BPSS1390-1408)僅在類鼻疽伯克霍爾德菌發(fā)現(xiàn)，鼻疽伯克霍爾德菌和泰國(guó)伯克霍爾德菌沒有;而T3SS2(BPSS1613-1629)和T3SS3(BPSS1520-1554)在這3個(gè)種屬的伯克霍爾德菌均存在［4］。T3SS1和T3SS2與植物致病性相關(guān)，是西紅柿感染伯克霍爾德菌必需的毒力因子，而非倉(cāng)鼠感染所必需。而T3SS3與沙門氏菌和志賀氏菌的Inv/Mxi-Spa系統(tǒng)存在同源性，在鼻疽伯克霍爾德菌和類鼻疽伯克霍爾德菌感染過程中有重要作用。該基因簇編碼的分泌體，功能類似于分子注射器，該系統(tǒng)的亞單位與真核細(xì)胞的細(xì)胞膜互作，把三型分泌系統(tǒng)的效應(yīng)分子轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的胞質(zhì)，然后破壞宿主細(xì)胞的細(xì)胞周期。體外研究表明，T3SS3能夠促進(jìn)病原菌對(duì)健康細(xì)胞的入侵、從內(nèi)涵體的逃脫、在細(xì)胞內(nèi)的存活和繁殖，并且是誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞凋亡所必需的因素。研究發(fā)現(xiàn)，傷寒沙門菌的T3SS突變體抑制了細(xì)胞的入侵和腸病發(fā)生。T3SS3突變的病原菌仍能夠從內(nèi)涵體逃脫，但與野生型相比，在時(shí)間上延遲。細(xì)菌內(nèi)化后，從內(nèi)吞體逃脫進(jìn)入細(xì)胞漿感染細(xì)胞。在一極誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白聚合形成膜突出從而發(fā)生細(xì)胞間的傳播。缺乏Bsa分泌和轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的類鼻疽伯克霍爾德菌突變體，降低在鼠類巨噬細(xì)胞的復(fù)制，不能從內(nèi)吞體逃脫、形成膜突出和肌動(dòng)蛋白聚合;BopE是與沙門菌SopE/SopE2同源的蛋白，該蛋白是鳥嘌呤核苷酸交換因子，失活該蛋白，可以減弱細(xì)菌進(jìn)入Hela細(xì)胞的能力，說明BopE促進(jìn)細(xì)菌入侵。此外，類鼻疽伯克霍爾德菌bsa位點(diǎn)編碼的沙門菌sip轉(zhuǎn)移子同源蛋白(BipB，BipC，BipD)，這些蛋白是沙門菌效應(yīng)蛋白注入和細(xì)菌入侵上皮細(xì)胞所必需的［5］。突變類鼻疽伯克霍爾德菌的bipD基因，該菌入侵上皮細(xì)胞的能力削弱。缺失轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的BipD突變體，病原菌腹腔內(nèi)或鼻內(nèi)感染BALB/c小鼠的能力減弱，在肝臟和脾臟的繁殖能力降低［6］。有研究表明［7］，BipB介導(dǎo)了多核大細(xì)胞的形成，細(xì)菌的細(xì)胞間傳播，以及被感染的宿主細(xì)胞的凋亡。BipB突變體病原菌削弱了BALB/c小鼠的鼻內(nèi)感染。

最新的研究表明，Ⅵ型分泌系統(tǒng)(Type VI Secretion System，T6ss)也是伯克霍德爾菌的毒力基因決定簇，T6ss基因簇編碼15～20個(gè)蛋白參與分泌系統(tǒng)的組裝、結(jié)構(gòu)和功能［8］。在類鼻疽伯克霍爾德菌的T6SS命名為tss-5，能夠誘導(dǎo)病原菌在巨噬細(xì)胞的生活周期;突變或缺失該基因，能夠減少細(xì)菌在上皮細(xì)胞的噬斑和細(xì)胞間的傳播。因此認(rèn)為tss-5是類鼻疽伯克霍爾德菌的重要毒力決定簇，但關(guān)于這個(gè)分泌系統(tǒng)的效應(yīng)分子目前還不清楚。

1．2 群感知系統(tǒng)

大多革蘭陰性菌通過產(chǎn)生N-乙酰同型絲氨酸(N-acyl-homoserine lactone，AHL)信號(hào)分子來監(jiān)控其自身在群感知系統(tǒng)中的群體密度。通常，高群體密度引起一系列后果，如致病需要的毒力因子功能的表達(dá)，這種基因調(diào)控的形式確保細(xì)菌保留在宿主的免疫系統(tǒng)中。直到他們足夠高的密度以壓倒宿主，并建立感染。

在B菌種存在這些信號(hào)分子的證據(jù)源自交叉培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AHL包含的營(yíng)養(yǎng)耗竭的培養(yǎng)基能夠刺激含鐵細(xì)胞、蛋白酶和脂酶的產(chǎn)生［9］。B菌第1個(gè)QS基因發(fā)現(xiàn)于轉(zhuǎn)座子突變的掃描中。BK56-2菌的QS系統(tǒng)由AHL合成酶CepI和轉(zhuǎn)錄調(diào)控子CepR組成，前者酶指導(dǎo)合成N-庚酰同型絲氨酸(C8-HSL)，檢測(cè)N-己酰同型絲氨酸(C6-HSL)的產(chǎn)生。在低種群密度時(shí)，細(xì)胞通過激活CepI合成酶產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的AHLs，隨著細(xì)菌密度增加，AHL信號(hào)分子在生長(zhǎng)介質(zhì)中積累，當(dāng)達(dá)到一個(gè)界限濃度，AHL結(jié)合到同源LuxR型受體蛋白CepR，從而誘導(dǎo)或抑制靶基因。CepR緊密控制cepI的表達(dá)，主要通過結(jié)合到lux盒子類似序列，該序列與cepI啟動(dòng)子的-35區(qū)部分重疊。這種正反饋調(diào)節(jié)保證一旦該系統(tǒng)啟動(dòng)，靶基因表達(dá)快速增加［10］。

研究B菌的群感知系統(tǒng)揭示，CepI/CepR系統(tǒng)正調(diào)節(jié)細(xì)胞外蛋白酶、殼多糖酶、多聚半乳糖醛酸酶的表達(dá)，菌群的運(yùn)動(dòng)，菌膜的形成，抑制鐵細(xì)胞分泌蛋白的合成。B．H111群感知系統(tǒng)缺陷的突變體僅形成平的未分化的生物膜。進(jìn)一步定量分析生物膜結(jié)構(gòu)表明［11］，CepI/CepR系統(tǒng)不參與細(xì)胞在非生命體表面的吸附，但控制生物膜的成熟。CepI/CepR系統(tǒng)影響B(tài)菌在不同宿主的毒力。

細(xì)胞密度依賴的群感知系統(tǒng)使用N-酰基同型絲氨酸內(nèi)酯(AHLs)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，LuxI負(fù)責(zé)AHL的生物合成，LuxR是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，還有一些同源的AHLs。這些蛋白因子參與基因表達(dá)或抑制基因表達(dá)。據(jù)報(bào)道，類鼻疽伯克霍爾德菌基因組包含3個(gè)LuxI和5個(gè)LuxR群感知系統(tǒng)同族體。質(zhì)譜分析類鼻疽伯克霍爾德菌培養(yǎng)物的上清液表明，該上清液存在許多信號(hào)分子，包括N-癸酰同型絲氨酸內(nèi)酯和N(3辛-癸酰)-L-同型絲氨酸內(nèi)酯。破壞群感知系統(tǒng)的這8個(gè)同源基因?qū)е赂骨粌?nèi)接種的敘利亞大鼠的半數(shù)致死量明顯增加，延長(zhǎng)了BALB/c小鼠從接種到死亡的時(shí)間，減少了病原菌對(duì)器官的侵襲。命名為PmlI-PmlR的LuxI-LuxR同源體，指導(dǎo)N-癸酰同型絲氨酸內(nèi)酯的合成，參與調(diào)解金屬蛋白酶合成，是該菌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染模型的毒力所必需，最佳毒力發(fā)揮和外源毒素分泌也需要同源物BpsI-BpsR的參與［12］。有些群感知系統(tǒng)控制潛在毒力因子和致病過程，如含鐵蛋白、磷酸酯酶C和菌膜的形成等都可能依賴于BpeAB-OprB，類鼻疽伯克霍爾德菌中眾所周知的一種多藥外排泵系統(tǒng)，與該菌的抗生素耐藥性如氨基糖苷和大環(huán)內(nèi)酯物的抗性有關(guān)。由于N-癸酰同型絲氨酸內(nèi)酯和N-辛酰同型絲氨酸內(nèi)酯能夠誘導(dǎo)BpeAB-OprB的表達(dá)，群感知系統(tǒng)調(diào)節(jié)BpeAB-OprB操縱子。BpeAB突變體弱化了該菌的細(xì)胞入侵和人類肺上皮細(xì)胞(A549)和人巨噬細(xì)胞(THP-1)的細(xì)胞毒性［13］。

1．3 莢膜多糖

類鼻疽伯克霍爾德菌的莢膜在普通光學(xué)顯微鏡下很難發(fā)現(xiàn)，在電子顯微鏡下可見到細(xì)菌外部附有一層絲狀物——莢膜多糖，由1，3鍵相連的多聚2-O-己酰基-6-脫氧-β-D-甘露糖-庚吡喃糖殘基構(gòu)成，先前認(rèn)為是I型O抗原多糖，現(xiàn)在基于高分子群體和遺傳相似性研究更傾向于是莢膜多糖。莢膜多糖是類鼻疽伯克霍爾德菌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染模型毒力所必需的。與野生型相比，在血清存在時(shí)誘導(dǎo)莢膜表達(dá)或在血清殺菌檢測(cè)中加入莢膜，能夠使類鼻疽伯克霍爾德菌SLR5(一種血清敏感菌株)的存活增加1 000倍。有莢膜的菌株和沒有莢膜的變異株在吞噬細(xì)胞吞入率尚沒有明顯差異，其莢膜的抗吞噬作用主要表現(xiàn)在抗溶菌酶體功能上，這一現(xiàn)象是類鼻疽潛伏期可長(zhǎng)達(dá)數(shù)10年之久的原因之一。有學(xué)者以同源重組的原理構(gòu)建了莢膜基因缺失突變株，試驗(yàn)證明莢膜的缺失導(dǎo)致補(bǔ)體C3b在菌體表面的沉積增多［14］。另外，莢膜還與該菌對(duì)環(huán)境的抵抗力和抗生素抗性有關(guān)。

1．4 脂多糖

脂多糖是先前命名的Ⅱ型O抗原多糖，類鼻疽伯克霍爾德菌的脂多糖似乎與其他革蘭陰性菌不同。與其他腸桿菌的脂多糖相比，該菌的脂多糖在嚙齒類動(dòng)物的產(chǎn)熱活性減弱，但增強(qiáng)了鼠類動(dòng)物脾細(xì)胞的促有絲分裂活性。與埃希大腸桿菌的脂多糖相比，該菌的脂多糖體外介導(dǎo)肥大細(xì)胞活化能力減慢［15］。

類鼻疽伯克霍爾德菌的O抗原分為I型和Ⅱ型。I型O抗原由1，3鍵相連的多聚2-O-己酰基-6-脫氧-β-D-甘露糖-庚糖殘基構(gòu)成。Ⅱ型 O 抗原由多聚(-3)-β-D-葡萄糖-(1，3)-脫氧-α-L-太羅糖構(gòu)成［16］。Ⅱ型O抗原基因缺失突變株對(duì)糖尿病模型動(dòng)物的LD50比野生型大140倍，所以Ⅱ型O抗原可能是該菌毒力的影響因子［17］。雖然人和動(dòng)物的補(bǔ)體能夠在菌體表面形成膜攻擊復(fù)合物，并且完成外膜打孔，但整體而言該菌有著很強(qiáng)的抗補(bǔ)體殺滅機(jī)制。近期的研究表明，Ⅱ型O抗原是抗補(bǔ)體殺滅作用的分子基礎(chǔ)。

1．5 Ⅳ型菌毛

Ⅳ型菌毛是許多革蘭陰性菌的重要毒力因子，與細(xì)菌的黏附有關(guān)。類鼻疽伯克霍爾德菌K9624基因組包含多個(gè)Ⅳ型菌毛相關(guān)位點(diǎn)，其中包括1個(gè)公認(rèn)的菌毛結(jié)構(gòu)蛋白PliA。體外研究表明，類鼻疽伯克霍爾德菌可以附著于人類肺泡、支氣管、喉部、口腔、結(jié)膜和子宮組織的上皮細(xì)胞系，而且30℃時(shí)接種細(xì)菌對(duì)這些上皮細(xì)胞的黏附能力比37℃更強(qiáng)。與其他伯克霍爾德菌相比，該菌對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞的入侵、黏附和細(xì)胞損傷更有效。缺失PliA蛋白，減少了細(xì)菌對(duì)人上皮細(xì)胞的黏附性、線蟲毒力模型的毒力以及鼠類類鼻疽發(fā)病，這些結(jié)果說明Ⅳ型菌毛在類鼻疽伯克霍爾德菌的毒力中起一定作用［18］。

1．6 鞭毛

類鼻疽伯克霍爾德菌鞭毛的氨基酸序列已經(jīng)清楚，碳端和氮端的氨基酸較為保守，中間部分的氨基酸序列具有一定的可變性，因而編碼這一段氨基酸序列的基因引起研究者的關(guān)注。有體外研究表明，野生型和鞭毛突變體病原菌在人肺細(xì)胞的入侵和復(fù)制沒有不同;而其他研究者的活體研究得出不同的結(jié)果，以轉(zhuǎn)座子誘變技術(shù)構(gòu)建了類鼻疽伯克霍爾德菌鞭毛基因(filC)缺失突變菌株，試驗(yàn)結(jié)果表明該菌株喪失了運(yùn)動(dòng)性，與原始菌株相比，失去對(duì)BALB/c小鼠的致病性，無論是通過鼻腔接種還是腹膜內(nèi)接種均不能引起發(fā)病;而另外的研究得出，野生型和鞭毛基因突變體在糖尿病小鼠和敘利亞大鼠的感染模型沒有差異［19］。

2 宿主的免疫機(jī)制

類鼻疽伯克霍爾德菌感染后機(jī)體能夠產(chǎn)生針對(duì)莢膜多糖、O-PS多糖和鞭毛蛋白等抗原成分的特異性抗體，抗體種類以IgG為主。這些抗體有一定的保護(hù)作用，但小劑量感染和持續(xù)暴露在污染環(huán)境所激發(fā)的抗體不足以避免病原菌的初期感染和復(fù)發(fā)。類鼻疽的保護(hù)性免疫以細(xì)胞免疫為主。

2．1 嗜中性粒細(xì)胞

血液中的嗜中性粒細(xì)胞是抗菌免疫的重要機(jī)制，對(duì)類鼻疽伯克霍爾德菌而言存在較多爭(zhēng)議。我國(guó)的研究者用電鏡觀察了模擬菌血癥條件下健康人嗜中性粒細(xì)胞吞噬和殺滅類鼻疽伯克霍爾德菌的過程。在細(xì)菌被吞入的初期，細(xì)菌形態(tài)完整，吞噬體和菌體大小一致。隨著殺滅功能的進(jìn)行，吞噬體變得很大，其內(nèi)的細(xì)菌呈松散狀，形態(tài)結(jié)構(gòu)已發(fā)生很大改變。在殺滅作用的后期，于吞噬體內(nèi)僅見殘留的細(xì)菌碎片。這一結(jié)果說明健康人的嗜中性粒細(xì)胞能夠殺滅類鼻疽伯克霍爾德菌［20］。

2．2 CD4+T 細(xì)胞

有研究認(rèn)為，抗原誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞免疫反應(yīng)在感染后期起主要作用［21］。患有類鼻疽的病人，其IgG，IgA和IgM的水平與疾病的嚴(yán)重性呈正相關(guān)。與局部感染的病人相比，全身浸潤(rùn)的病人抗體水平更高。類鼻疽與特異性人白細(xì)胞抗原(HLA)二類分子存在關(guān)聯(lián)。HLA二類分子DRBI1602與急性敗血型類鼻疽呈正相關(guān)，而DQA1*03與其呈負(fù)相關(guān)。由于類鼻疽伯克霍爾德菌抗原反射性增強(qiáng)了淋巴細(xì)胞增殖和INF-γ的產(chǎn)生，類鼻疽恢復(fù)的患者表現(xiàn)抗原特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)。測(cè)定類鼻疽伯克霍爾德菌抗原淋巴細(xì)胞反應(yīng)顯示，與曾經(jīng)患過類鼻疽的人相比，無臨床癥狀的潛伏期患者表現(xiàn)較強(qiáng)的細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的INF-γ激活了巨噬細(xì)胞，從而使巨噬細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺菌活性，也就是說，INF-γ增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)殺菌活性。最近的研究表明，類鼻疽伯克霍爾德菌特異的CD4+T細(xì)胞在鼠類宿主感染后期抑制病原菌起到重要作用。但對(duì)CD4+T細(xì)胞在控制病原菌感染方面的重要性仍存在公開的爭(zhēng)議。因?yàn)槟壳皼]有發(fā)現(xiàn)HIV和類鼻疽感染之間存在相關(guān)性。

2．3 補(bǔ)體系統(tǒng)

眾所周知，補(bǔ)體系統(tǒng)在抗革蘭氏陰性菌感染中發(fā)揮著重要的作用。補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)革蘭陰性菌外膜的直接損傷被認(rèn)為是補(bǔ)體系統(tǒng)殺滅革蘭陰性菌的重要環(huán)節(jié)，細(xì)菌的最終死亡有賴于隨后的一系列生物學(xué)過程。類鼻疽伯克霍爾德菌能夠快速和有效的激活補(bǔ)體。補(bǔ)體的激活導(dǎo)致C3補(bǔ)體在細(xì)菌表面沉積并進(jìn)一步調(diào)理化。粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對(duì)類鼻疽伯克霍爾德菌的黏附和吞噬作用依賴于調(diào)理素的存在和巨噬細(xì)胞膜上表達(dá)的補(bǔ)體受體CR1和CR3的參與。莢膜多糖通過減少補(bǔ)體因子C3b的沉積抵御吞噬作用。但是有資料表明類鼻疽伯克霍爾德菌有抗補(bǔ)體的作用。類鼻疽伯克霍爾德菌能夠抑制補(bǔ)體的細(xì)胞溶解酶活性，其他致病菌如包柔螺旋體菌、沙門菌、奈瑟菌以及鏈球菌均有該特性。補(bǔ)體成為類鼻疽伯克霍爾德菌體內(nèi)潛藏的場(chǎng)所。補(bǔ)體能夠增強(qiáng)吞噬作用，但有證據(jù)表明，類鼻疽伯克霍爾德菌可在吞噬細(xì)胞內(nèi)存活和繁殖，包括巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，利用多種機(jī)制逃避巨噬細(xì)胞的殺菌作用和宿主細(xì)胞的免疫作用，這些機(jī)制包括抵抗人的防御蛋白和抑制細(xì)胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)的合成。超微結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，病原菌能夠存在于膜結(jié)合體特別是吞噬溶酶體，從而能在酸性環(huán)境中生存與生長(zhǎng);被吞噬的病原菌能夠阻止吞噬體和溶酶體的融合并在15 min內(nèi)破壞吞噬體的膜結(jié)構(gòu)，這種現(xiàn)象在類鼻疽感染患者體內(nèi)也得到證實(shí)。當(dāng)巨噬細(xì)胞與大腸桿菌、沙門菌等病原菌作用時(shí)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生一氧化氮合酶和α-腫瘤壞死因子，但類鼻疽伯克霍爾德菌可阻礙誘生型一氧化氮合酶的表達(dá)，并抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生對(duì)抗巨噬細(xì)胞的殺菌作用。在感染類鼻疽伯克霍爾德菌的人類組織中，偶爾可見多核巨細(xì)胞和大的巨噬細(xì)胞，這可能是由于病原菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活，細(xì)胞半衰期延長(zhǎng)，降低了細(xì)胞的殺菌能力。類鼻疽伯克霍爾德菌可誘導(dǎo)蛋白酶依賴的宿主細(xì)胞死亡，逃避巨噬細(xì)胞的殺菌作用;而細(xì)胞死亡伴隨IL-1β和IL-18的釋放。在保護(hù)性生物膜中膠囊化的菌落也可延長(zhǎng)細(xì)菌在靜止?fàn)顟B(tài)的生活周期［21～23］。

2．4 細(xì)胞因子

細(xì)胞因子在類鼻疽伯克霍爾德菌感染的免疫保護(hù)反應(yīng)中起到重要作用，臨床研究證明，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)能夠提高重癥類鼻疽患者的存活率。糖尿病能夠損害嗜中性粒細(xì)胞的趨化、吞噬和殺傷功能。其他風(fēng)險(xiǎn)因素如地中海貧血、酒精中毒、慢性腎功能衰竭等也有相似作用。G-CSF的使用能夠?qū)惯@些不利因素的影響［24］。

促炎癥細(xì)胞因子γ干擾素(INF-γ)在早期抵御類鼻疽伯克霍爾德菌感染具有重要作用［25～27］。抑制鼠表達(dá)INF-γ，其ID50從5×106降低至2 CFU，而且肝臟細(xì)菌數(shù)增加8 500倍，脾臟細(xì)菌數(shù)增加4 400倍。抑制INF-γ內(nèi)源生成誘導(dǎo)因子IL-12和IL-18表達(dá)，增加了同型動(dòng)物感染模型的死亡率。細(xì)胞內(nèi)感染類鼻疽伯克霍爾德菌主要引起1型T細(xì)胞免疫反應(yīng)(Th1)，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，其中INF-γ，IL-12和IL-18最先產(chǎn)生。這些細(xì)胞因子能夠增強(qiáng)吞噬和胞內(nèi)菌的殺傷作用。細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞在INF-γ的作用下，能促進(jìn)感染病原菌細(xì)胞的凋亡。INF-β能夠促進(jìn)誘生型一氧化氮合酶的表達(dá)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的抗菌活性。另一個(gè)重要的促炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子(TNF-α)在類鼻疽伯克霍爾德菌感染的早期免疫也起到重要作用。抵抗巨噬細(xì)胞源細(xì)胞因子的被動(dòng)免疫增加了實(shí)驗(yàn)感染鼠的死亡率;類鼻疽患者血清中的INF-γ，IL-12和TNF-α濃度升高。TNF-α啟動(dòng)子的多態(tài)性與類鼻疽感染存在與否及感染嚴(yán)重性有關(guān)。

3 展 望

盡管關(guān)于類鼻疽發(fā)病機(jī)制有許多較為詳盡的研究，也有眾多研究者從假定毒力因子及其病原宿主免疫互作方面進(jìn)行了諸多探討。基因組信息和芯片分子技術(shù)工具的采用，該病原菌的分子和細(xì)胞致病機(jī)制的探索也初見成效。然而從Whitemore發(fā)現(xiàn)鼻疽伯克霍爾德菌至今，其感染發(fā)病的每一個(gè)過程仍有許多問題尚未探明。未來的研究應(yīng)著重從以下幾個(gè)方面進(jìn)行:(1)進(jìn)一步明確鼻疽伯克霍爾德菌對(duì)上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吸附、入侵和細(xì)胞內(nèi)存活機(jī)制;(2)進(jìn)而了解細(xì)菌傳播的機(jī)制;(3)探索細(xì)菌如何與免疫系統(tǒng)互作導(dǎo)致疾病暴發(fā)的機(jī)制，這是開發(fā)多功能疫苗的基礎(chǔ)。

［1］GEORGE M G．Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology:Volume Two［M］．New York:Springer，2005．

［2］WHITE N J．Melioidosis［J］．Lancet，2003，361:1 715-1 722．

［3］WIERSINGA W，VAN DER POLL T，WHITE N J，et al．Melioidosis:insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei［J］．Nature Reviews/Microbiology，2006，4:272-282．

［4］SUN G，GAN Y．Unraveling type III secretion systems in the highly versatile Burkholderia pseudomallei［J］．Cell:Trends in Microbiology，2010，18(12):561-568．

［5］ATTREE O，ATTREE I．A second type III secretion system in Burkholderia pseudomallei:who is the real culprit［J］．Microbiology，2001，147:3 197-3 199．

［6］BURTNICK M N，BRETT P J，NAIR V，et al．Burkholderia pseudomallei Type III secretion system mutants exhibit delayed vacuolar escape phenotypes in RAW 264．7 murine macrophages［J］．Infect Immun，2008，76:2 991-3 000．

［7］EDOUARD E G，PAUL J B，DAVID D．Molecular insights into Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei pathogenesis［J］．Annu Rev Microbiol，2010，64:495-517．

［8］FILLOUX A，HACHANI A，BLEVES S．The bacterial type VI secretion machine:yet another player for protein transport across membranes［J］．Microbiology，2008，154:1 570-1 583．

［9］CHAN Y Y，CHUA K L．The Burkholderia pseudomallei Bpe AB-OprB efflux pump:expression and impact on quorum sensing and virulence［J］．J Bacteriol，2005，187:4 707-4 719．

［10］CHAN Y Y，BIAN H S，TAN T M，et al．Control of quorum sensing by a Burkholderia pseudomallei multidrug efflux pump［J］．J Bacteriol，2007，189:4 320-4 324．

［11］RATISIN P，SANMEE S．Roles and interactions of Burkholderia pseudomallei BpsIR quorum-sensing system determinants［J］．J Bacteriol，2008，190:7 291-7 297．

［12］EDOUARD E G，PAUL J B，DAVID D．Molecular insights into Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei pathogenesis［J］．Annu Rev Microbiol，2010，64:495-517．

［13］LAZAR ADLER N R，GOVAN B，CULLINANE M，et al．The molecularand cellular basis of pathogenesis inmelioidosis:how does Burkholderia pseudomallei cause disease［J］．FEMS Microbiol Rev，2009，33:1 079-1 099．

［14］SARKAR-TYSON M，TITBALL R W．Progress toward development of vaccines against melioidosis［J］．Annu Review，2010，32(8):1 437-1 445．

［15］ARJCHAROEN S，WIKRAIPHAT C，PUDLA M，et al．Fate of a Burkholderia pseudomallei lipopolysaccharide mutant in the mouse macrophage cell line RAW 264．7:possible role for the O-antigenic polysaccharide moiety of lipopolysaccharide in internalization and intracellular survival［J］．Infect Immun，2007，75:4 298-4 304．

［16］PERRY M B，MACLEAN L L，SCHOLLAARDT T，et al．Structural characterization of the lipopolysaccharide O antigens of Burkholderia pseudomallei［J］．Infect Immun，1995，63:3 348-3 352．

［17］DESHAZER D，BRETT P J，WOODS D E．The type II O-antigenic polysaccharide moiety of Burkholderia pseudomallei lipopolysaccharide is required for serum resistance and virulence［J］．Mol Microbiol，1998，30:1 081-1 100．

［18］BODDEY J A，F(xiàn)LEGG C P，DAY C J，et al．Temperature-regulated microcolony formation by Burkholderia pseudomallei requires pilA and enhances association with cultured human cells［J］．Infect Immun，2006，74:5 374-5 381．

［19］CHUA K L，CHAN Y Y，GAN Y H．Flagella are virulence determinants of Burkholderia pseudomallei［J］．Infect Immun，2003，71:1 622-1 629．

［20］宋陽(yáng)，蔣忠軍，佟世德．人多形核白細(xì)胞殺滅類鼻疽桿菌的電鏡觀察［J］．中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2001，21(2):131-133．

［21］GAN Y H．Interaction between Burkholderia pseudomallei and the host immune response:sleeping with the enemy［J］．J Infect Dis，2005，192:1 845-1 850．

［22］EGAN A M，GORDON D L．Burkholderia pseudomallei activates complement and is ingested but not killed by polymorphonuclear leukocytes［J］．Infect Immun，1996，64:4 952-4 959．

［23］JONES A L，DESHAZER D，WOODS D E．Identification and characterization of a two-component regulatory system involved in invasion of eukaryotic cells and heavy-metal resistance in Burkholderia pseudomallei［J］．Infect Immun，1997，65:4 972-4 977．

［24］EKCHARIYAWAT P，PUDLA S，LIMPOSUWAN K，et al．Burkholderia pseudomallei-induced expression of suppressor of cytokine signaling 3 and cytokine-inducible Src homology 2-containing protein in mouse macrophages:a possible mechanism for suppression of the response to gamma interferon stimulation［J］．Infect Immun，2005，73:7 332-7 339．

［25］LAUW F N，SIMPSON A J，PRINS J M，et al．Elevated plasma concentrations of interferon(IFN)-gamma and the IFN-gamma-inducing cytokines interleukin(IL)-18，IL-12，and IL-15 in severe melioidosis［J］．J Infect Dis，1999，180:1 878-1 885．

［26］LAUW F N，SIMPSON A J，PRINS J M，et al．The CXC chemokines gamma interferon(IFN-gamma)inducible protein 10 and monokine induced by IFN-gamma are released during severe melioidosis［J］．Infect Immun，2000，68:3 888-3 893．

［27］KOO G C，GAN Y H．The innate interferon gamma response of BALB/c and C57BL/6 mice to in vitro Burkholderia pseudomallei infection［J］．BMC Immunology，2006，7:19．

［28］BONDI S K，GOLDBERG JB．Strategies toward vaccines against Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei［J］．Expert Rev Vaccines，2008，7(9):1 357-1 365．