生物傳感器在食品安全中的應(yīng)用

孟邵華，高麗娟，羅馬慧，王鴻飛，胡富陶，*

（1.寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.寧波大學(xué)材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 寧波 315211）

隨著經(jīng)濟全球化進程的加快，食品安全已成為當(dāng)今世界性公共衛(wèi)生熱點[1]。食品中致病菌如大腸桿菌O157∶H7、李斯特氏菌、傷寒沙門氏菌等在條件合適時增長極快，可引發(fā)各種流行性疾病。美國疾病控制和預(yù)防中心（CDC）估計，美國每年由上述幾種致病菌造成大約7600萬例疾病，3215萬例住院治療，5200例死亡[1]，而由此造成的醫(yī)療花費和生產(chǎn)力損失，每年達29億～67億美元[2]。因此對其進行實時在線監(jiān)測對于食品安全意義重大。通用的檢測方法由分離培養(yǎng)、鏡檢觀察、生化鑒定等組成，步驟繁瑣且精度低。聚合酶鏈反應(yīng)法，酶聯(lián)免疫吸附法等也均需通過富集、分離、形態(tài)學(xué)檢測、生物化學(xué)和血清學(xué)測試來鑒別，雖比傳統(tǒng)方法需要的檢測時間短，但仍達不到實際要求。因此建立一種快速、方便、可靠的食品中主要致病菌安全檢測技術(shù)，以防止傳染疾病和經(jīng)濟損失，是一個迫切的需求。生物傳感器因其特異性好、分析速度快、成本低，在食品安全檢測領(lǐng)域正發(fā)揮著重要的應(yīng)用價值。

1 生物傳感器的原理及優(yōu)點

生物傳感器是將生物識別元件和信號轉(zhuǎn)換元件緊密結(jié)合，從而檢測目標(biāo)化合物的分析裝置[3]。其基本原理為：待測物質(zhì)和分子識別元件特異性結(jié)合，發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生的生物學(xué)信息通過信號轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)化為可以定量處理的電、光等信號，再經(jīng)儀表放大和輸出，從而達到分析檢測的目的。

與傳統(tǒng)的分析方法相比，生物傳感器具有如下優(yōu)點[4]：①敏感物質(zhì)經(jīng)固定化可重復(fù)使用；②檢測樣品一般不需要進行預(yù)處理，除緩沖液外無需其他試劑；③樣品中被測組分的分離和檢測可以同時完成，分析操作簡單；④可以實現(xiàn)連續(xù)監(jiān)側(cè)，容易實現(xiàn)自動化測量；⑤響應(yīng)快，樣品用量微；⑥對樣品的清晰度(即樣品的混濁程度)不作要求，生物傳感器可以檢測較混濁的樣品，而不影響測定結(jié)果；⑦傳感器連同側(cè)定儀的成本遠低于大型分析儀器，便于推廣普及。鑒于這些優(yōu)點，目前己經(jīng)在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。在食品領(lǐng)域中，生物傳感器更是各學(xué)者研究的熱點。

2 生物傳感器在食品安全檢測中的應(yīng)用

2.1 食品中致病菌的檢測

Koubova魦和VGertie等[5]實現(xiàn)了用SPR生物傳感器實時檢測腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）和單核細胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）。該傳感器的檢測限是106cells/mL，靈敏性和標(biāo)準(zhǔn)ELISA相當(dāng)。

Liu等[6]用免疫磁分離技術(shù)和吸光率的測量實現(xiàn)了Escherichia coliO157∶H7的快速檢測,總檢測時間不超過2 h。

Su等[7]研究了一個靈敏的、特定的、快速檢測E.coliO157：H7的方法,該方法同時采用量子點（QDs）作為熒光標(biāo)記和免疫磁性分離技術(shù)。研究結(jié)果表明：在103cfu/mL～107cfu/mL范圍內(nèi)，熒光發(fā)射強度的峰值和E.coliO157∶H7的初始細胞濃度成比例，檢測限比FITC方法至少要低100倍。總檢測時間少于2 h。

Leonard P等[8]采用Biacore 3000生物傳感器來檢測Listeria monocytogenes。他們首先將Listeria monocytogenes細胞和抗體孵育一小段時間，接著用逐步離心法來分離未被綁定的抗體。自由抗體流過經(jīng)修飾的傳感芯片表面，由此產(chǎn)生的響應(yīng)信號與抑制細胞的濃度成反比。30 min內(nèi)，檢測限可達到1×105cells/mL。研究表明，該方法簡單、快速，并且只需少量的樣品準(zhǔn)備。這種檢測方法能夠在樣品有限的情況下，實現(xiàn)快速、靈敏的致病菌檢測。

Subramanian等[9]研究了表面等離子體共振（SPR）免疫傳感器檢測E.coliO157∶H7的靈敏性和特異性。他們采用自組裝膜法固定抗體，把純單克隆或者多克隆抗E.coliO157∶H7抗體固定到傳感器芯片表面，并對E.coliO157∶H7進行直接檢測和抗體夾心檢測。他們研究了蛋白G檢測的效果和不同濃度的一抗、二抗下“三明治”檢測的效果。研究結(jié)果顯示：“三明治”檢測方法中,該傳感器的檢測限可達到103cfu/mL，且對腸炎沙門氏菌有很高的特異性。直接檢測和蛋白G檢測的檢測限分別是106cfu/mL和104cfu/mL。因此，他們得出結(jié)論：基于烷烴硫醇自組裝膜的SPR生物傳感器采用“三明治”方法,能夠快速、特定的檢測E.coliO157∶H7。

王凱等[10]使用集成化手持式Spreeta TM SPR傳感器快速檢測沙門氏菌，利用親和素-生物素系統(tǒng)保證檢測的準(zhǔn)確性；利用沙門氏菌抗體的免疫吸附反應(yīng)，保證結(jié)果的特異性；并引入復(fù)合抗體作為第二抗體以擴大檢測的響應(yīng)信號，檢測到鼠傷寒沙門氏菌的濃度為105cfu/mL，整個檢測過程在1 h內(nèi)完成,從一定程度實現(xiàn)了食品中病原微生物的快速檢測。

李杜娟等[11]建立了一種采用電化學(xué)阻抗譜技術(shù)快速檢測大腸桿菌O157∶H7的生物傳感器，通過石英晶體金電極表面附著一層蛋白A膜來固定抗體的。該生物傳感器采用了三電極系統(tǒng)—工作電極石英晶體金電極、Ag/AgCl/Cl-SAT參考電極和鉑對電極。試驗結(jié)果說明抗體的固定以及大腸桿菌O157∶H7與抗體的結(jié)合都增加了石英晶體金電極表面的電子傳遞阻抗，在[Fe（CN）6]3-氧化還原對存在的情況下，用電化學(xué)阻抗譜測量該阻抗。該免疫生物傳感器的檢測限是103cfu/mL，石英晶體金電極的電子傳遞阻抗變化值和大腸桿菌O157∶H7的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢測時間少于10 min。

2.2 食品中農(nóng)獸藥殘留檢測

Zheng等[12]研制了一種基于固定化雞肝酶的流動注射量熱式生物傳感器檢測敵敵畏殘留。他們用雞肝酶代替乙酰膽堿酯酶作為生物識別元件,反應(yīng)溫度固定在40℃。當(dāng)?shù)孜锿ㄟ^注射閥注入到系統(tǒng)中時，在酶反應(yīng)室里發(fā)生催化反應(yīng)，非酶反應(yīng)產(chǎn)生的熱通過參比室用來排除。用熱電偶的傳感器測量2個反應(yīng)室的溫度變化。在敵敵畏濃度為1 mg/L和10 mg/L的情況下,酶反應(yīng)的抑制率分別為30.7%和41.8%。實驗證明這種量熱式生物傳感器可用作農(nóng)藥的快速檢測。

蔣雪松等[13]建立了一種壓電免疫生物傳感器結(jié)合流動注射的方法檢測樣品中的農(nóng)藥殘留。為了有效地捕獲有機磷農(nóng)藥抗原，比較了3種在石英晶體金電極表面上固定有機磷單克隆抗體的方法。實驗表明：在0.005μg/mL～10μg/mL范圍內(nèi)，有機磷濃度與晶體頻率的變化之間呈較好的相關(guān)關(guān)系。回歸方程：y=5.9111ln（x）+51.979，決定系數(shù)為：0.93。該傳感器的最低檢測限為2.16×10-3μg/mL，選擇性好，可以重復(fù)使用。

MAURIZ[14-15]等制備了毒死蜱的單克隆抗體，并運用SPR生物傳感方法檢測了飲用水中的有機磷農(nóng)藥毒死蜱，最低檢測限為55ng/L，此外該研究小組還運用SPR方法測定了水中的有機氯農(nóng)藥DDT、有機磷農(nóng)藥毒死蜱和氨基甲酸酯類農(nóng)藥化合物，各自最低檢測限分別為 20、50、0.9ng/L。

黃強力等[16]利用SPR生物傳感器快速檢測動物源性食品中殘留的醋酸甲羥孕酮（MPA），對抗原的固定條件、抗體的濃度及芯片再生條件進行了優(yōu)化，同時對抗體的穩(wěn)定性及特異性進行了分析。結(jié)果顯示，該方法檢測的最低限約為1ng/mL。利用模擬標(biāo)本進行平行測試表明,其與進口ELISA檢測試劑盒結(jié)果基本一致。SPR生物傳感器檢測MPA，單個樣品的檢測時間小于5 min，非常適合現(xiàn)場的快速檢測，具有廣泛的應(yīng)用前景。

李輝等[17]利用表面等離子體共振生物傳感器對萊克多巴胺抗體與固定在芯片表面的萊克多巴胺衍生物的相互作用進行了分析，解離常數(shù)為2.56×10-6/s。根據(jù)一定范圍內(nèi)相對響應(yīng)值和時間近似呈線性關(guān)系的動力學(xué)特性，建立了連續(xù)檢測的方法，從而簡化了實驗步驟，有利于提高芯片的使用壽命。檢測萊克多巴胺采用抑制法，將萊克多巴胺衍生物固定在芯片的表面，萊克多巴胺抗體與樣品混合后流過芯片的表面，所得相對響應(yīng)值與樣品中萊克多巴胺的濃度成反比。單個樣品的檢測時間設(shè)定為15 min，對應(yīng)的檢出限小于 4μg/L。

2.3 食品中其他物質(zhì)的檢測

Gustavsson等[18]用基于生物傳感器的表面等離子共振（SPR）設(shè)計了檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺類抗生素的實驗。將帶有羧肽酶活性的微生物受體蛋白用作探測分子，在β-內(nèi)酰胺類抗生素存在時，受體蛋白和抗生素之間形成穩(wěn)定的復(fù)合物，抑制了蛋白酶的活性，從而可以通過酶活性的降低值，定性地檢測出牛奶中的青霉素G。這種方法的檢測極限為2.6μg/kg，低于歐洲4μg/kg的最大殘留限（MRL）。

Carla C Rosa等[19]利用光學(xué)生物傳感器對亞硝酸鹽進行檢測，用絡(luò)合沉淀凝膠法（CPG法）將一種亞硝酸鹽還原酶固定在光纖一端的可控微孔玻璃珠上，當(dāng)亞硝酸鹽與酶發(fā)生接觸反應(yīng)時，會發(fā)生一系列分光變化，且這種光學(xué)變化與亞硝酸鹽的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，通過檢測這些光學(xué)變化即可對亞硝酸鹽進行定量分析。其檢測限為0.93 mol/L，大大低于歐盟所要求的最大限量2.2 mol/L。

上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院的研究人員根據(jù)競爭酶免疫反應(yīng)原理設(shè)計的傳感器在檢測肉類食品中的激素殘留獲得了較好的效果。其設(shè)計的己烯雌酚傳感器是由過氧化氫電極和己烯雌酚抗體膜組成,將一定量的過氧化氫酶標(biāo)記的己烯雌酚加到待測樣品中,酶標(biāo)記的及未標(biāo)記的己烯雌酚會與膜上的己烯雌酚抗體發(fā)生競爭反應(yīng),測定酶標(biāo)己烯雌酚與抗體的結(jié)合率便可知食品中己烯雌酚的含量[20]。

Carter等[21]利用光纖免疫傳感器來測定花生和玉米抽提物中的AFB1，檢測限可達0.05ng/m L。

Kreuzer等[22]用酶免疫傳感器法檢測河豚毒素（TTX）。實驗結(jié)果:線性范圍為0.1ng/mL～100ng/mL，最低檢出限為0.016ng/mL。

Frevert等[23]采用熒光標(biāo)記抗體生物傳感器測定肉毒梭菌毒素，利用抗原固定化到波導(dǎo)表面上，并與熒光標(biāo)記抗體反應(yīng)，樣品中游離抗原抑制抗體的結(jié)合，從而利用熒光強度的降低，達到定量分析的目的，結(jié)果表明該方法可測定200ng/mL的毒素。

Rasooly等[24]用抗體作為檢測器做成了一個實時生物傳感器，用于檢測牛奶、熱狗等食品中的葡萄糖球菌腸毒素，靈敏度可達10ng/g～100ng/g，而且檢測過程不超過4 min。

石婷等[25]采用基于表面等離子體共振技術(shù)的光學(xué)傳感器，通過自組裝分子技術(shù)將單克隆抗體固定到傳感器金膜表面用于檢測對應(yīng)抗原，即待測抗生素，并記錄傳感器表面液體折射率的變化曲線，其反映了被吸附抗生素的濃度的大小。對不同濃度的氨芐青霉素水溶液進行了測定，得到該傳感器的工作曲線，整體工作曲線呈單調(diào)上升，且線性關(guān)系較好，同時得到了該檢測方法的最低檢測極限為1.25ng/mL，明顯低于歐盟規(guī)定的最大殘留限量（4μg/kg）。

3 展望

食品安全檢測過程中，常常經(jīng)過繁雜的前處理，需要大量復(fù)雜、昂貴的儀器，且難于實現(xiàn)現(xiàn)場檢測，生物傳感器的研發(fā)和使用不僅減少了分析時間，提高了靈敏度，使測定過程變得更為簡單，便于實現(xiàn)自動化。但因其起步較晚，針對目前的研究現(xiàn)狀與發(fā)展實際，在實際推廣應(yīng)用前，還有許多需要探索和改進的地方。開發(fā)新一代低成本、高靈敏度、高穩(wěn)定性和高壽命的生物傳感器已成了目前研究的熱點。相信不久的將來，隨著生物學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)、電子學(xué)、材料等技術(shù)的不斷進步,生物傳感器將在食品安全檢測和整個農(nóng)業(yè)工程領(lǐng)域里被廣泛應(yīng)用。

[1]李杜娟,王劍平,應(yīng)義斌,等.檢測食源性致病菌的生物傳感器[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報,2007,23(3):194-199

[2]梅玲玲,程蘇云,朱敏,等.2000～2004年浙江省食品中產(chǎn)單核李斯特菌污染狀況調(diào)查[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2006,16(7):784-786

[3]Thévenot D R,Toth K,DurstR A,et al.Electrochemical biosensors recommended definitions and classification[J]. Biosensors and bioelectronics,2001,16(1/2):121-131

[4]烏日娜,李建科.生物傳感器在農(nóng)藥殘留分析中的研究現(xiàn)狀及展望[J].食品與機械,2005,21(3):54-56

[5]Koubova魦 V,Brynda E,Karasova魦 L,et al.Detection of foodborne pathogens using surface plasmon resonance biosensors[J].Sensors and actuators B,2001,74(1/3):100-105

[6]Liu Y,Li Y.Detection of Escherichia coli O157∶H7 using immuno-magnetic separation and absorbance measurement[J].Microbiol methods,2002,51(3):369-377

[7]Su X,Li Y.Quantum dot biolabeling coupled with immunomagnetic separation for detection of Escherichia coli O157∶H7[J].Anal Chem,2004,76(16):4806-4810

[8]Leonard P,Hearty S,Quinn J,et al.A generic approach for the detection of whole Listeria monocytogenes cells in contaminated samples using surface plasmon resonance[J].Biosens bioelectron 2004,19(10):1331-1335

[9]Subramanian A,Irudayaraj J,Ryan T.A mixed self-assembled monolayer-based surface plasmon immunosensor for detection of E.coli O157:H7[J].Biosens bioelectron,2006,21(7):998-1006

[10]王凱,殷涌光.SPR生物傳感器在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用研究[J].傳感器與微系統(tǒng),2007,26(5):12-17

[11]李杜娟,王劍平,蓋玲,等.快速檢測大腸桿菌O157∶H7的電化學(xué)阻抗免疫生物傳感器[J].傳感技術(shù)學(xué)報,2008,5(21):709-714

[12]Zheng Y H,Hua T C,Sun D W,et al.Detection of dichlorvos residue by flow injection calorimetric biosensor based on immobilized chicken liver esterase[J].J Food Eng,2006,74(1):24-29

[13]蔣雪松,王劍平,葉尊忠,等.用于農(nóng)藥殘留快速檢測的壓電免疫生物傳感器的研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,2008,6(24):189-192

[14]Mauriz E,Calle A.Real-time detection of chlorpyrifos at part per trillion levels in ground,surface and drinking water samples by a portable surface plasmon resonance immunosensor[J].Analytica chimica acta,2006,561(1/2):40-47

[15]Mauriz E,Calle A,Montoya A,et al.Determination of environmental organic pollutans with a potable optical immunosensor[J].Talanta,2006(7):359-364

[16]黃強力,王晶鈺,韓雪清,等.SPR生物傳感器快速檢測醋酸甲羥孕酮的初步應(yīng)用研究[J].中國畜牧獸醫(yī),2010,37(3):102-104

[17]李輝,蔡浩原,陳興,等.表面等離子體共振生物傳感器連續(xù)檢測萊克多巴胺[J].分析化學(xué)研究簡報,2010,38(3):381-384

[18]Gustavsson E,Bjurling P,Sternesj O A.Biosensor analysis of penicillin G in milk based on the inhibition of carboxypeptidase activity[J].Analytica Chemica Acta,2002,468(1):153-159

[19]Carla C Rosa,Helder J Craz,Monica Vida,et al.Optial biosensor based on nitrite reductase immobilized in controlled pore glass[J].Biosensors bioelectronics,2002,17(1/2):45-52

[20]朱將偉,柴春彥,劉國艷,等.檢測動物性產(chǎn)品中殘留己烯雌酚的免疫傳感器的研制[J].糧食與飼料工業(yè),2005(7):44-45

[21]Reijula K,Tuomi T.Mycotoxin sof Aspergill exposure and heal effects[J].Frontiersin Bioscience,2003,8:232-235

[22]郭柏坤.河豚毒素的免疫檢測進展[J].時珍國醫(yī)國藥,2006,17(4):628-629

[23]許牡丹.生物傳感器在食品安全檢測中的應(yīng)用[J].食品研究與開發(fā),2004,25(4):128-130

[24]Zalaca IN A,Ordoud I S A,Blazquez I,et al.Screening method for the detection of artificial colours in saffron using derivative UV2Vis spectrometry after precip itation of crocetin[J].Food additives&contaminants,2005,22(7):607-615

[25]石婷,劉瑾,張婉潔,等.基于SPR生物傳感器的抗生素殘留檢測及影響因素分析[J].天津大學(xué)學(xué)報,2010,43(3):255-261