微生物檢測技術(shù)及其在食品安全中的應(yīng)用

李勤

（四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 都江堰 611830）

近年來在不同的國家和地區(qū)相繼發(fā)生了許多與食品有關(guān)的安全問題，如1991年中國上海發(fā)生的毛蚶甲肝病毒導(dǎo)致30萬人中毒，1994年美國發(fā)生的腸炎沙門氏菌污染巴氏消毒液態(tài)冰淇凌導(dǎo)致22萬人中毒，1996年日本腸出血性大腸桿菌O157：H7導(dǎo)致9450人中毒等。據(jù)2012年2月2日，我國衛(wèi)生部通報，2011年第三季度，我國共報告食物中毒類突發(fā)公共衛(wèi)生事件73起，中毒3224人，其中死亡61人；按中毒原因分類，微生物性食物中毒事件的報告起數(shù)和中毒人數(shù)最多，分別占總報告起數(shù)和中毒人數(shù)的47.9%和70.7%。隨著人們生活水平的提高，安全意識的增強，對食品安全提出了更高的要求，食品安全已成為全球關(guān)注的焦點，現(xiàn)代食品微生物檢測技術(shù)的發(fā)展和在食品安全檢測中的應(yīng)用也越來越受到人們的重視。

1 現(xiàn)代食品微生物檢測技術(shù)研究的主要內(nèi)容

現(xiàn)代食品微生物檢測技術(shù)是以微生物學(xué)為基礎(chǔ)，運用現(xiàn)代免疫學(xué)、分子生物學(xué)、自動化儀器、生物傳感器等方面的理論和技術(shù)，研究食品中的微生物，特別是病原微生物的種類、數(shù)量、性質(zhì)等，并建立的現(xiàn)代食品微生物檢測方法。該方法具有簡便、快速、準(zhǔn)確、高效、靈敏度高等特點，可以快速檢出食品中的病原微生物，迅速對食品的衛(wèi)生質(zhì)量進行評價。

現(xiàn)代食品微生物檢測技術(shù)研究的內(nèi)容主要有：食源性病原菌免疫學(xué)快速檢測技術(shù)、食源性病原菌分子生物學(xué)快速檢測技術(shù)、生理生化代謝產(chǎn)物的檢測技術(shù)、食源性病原菌自動化檢測技術(shù)、食源性致病菌生物傳感器檢測技術(shù)[1]，分別簡要介紹如下。

1.1 食源性病原菌免疫學(xué)快速檢測技術(shù)

1.1.1 熒光抗體檢測技術(shù)（FAT）

FAT技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的基本原理，用熒光素來標(biāo)記抗體或抗原再與待測樣品中的抗體或抗原結(jié)合，通過熒光顯微鏡觀察的一種方法。該法有直接法和間接法兩種，直接法是在待測樣品上直接添加已知熒光素標(biāo)記的抗血清，經(jīng)洗滌后在熒光顯微鏡下觀察的一種方法。間接法是在待測樣品上滴加己知細菌的特異性抗體，與樣品反應(yīng)后經(jīng)洗滌，再加入熒光標(biāo)記的第二、第三抗體的方法。如抗沙門氏菌的熒光抗體，可用于750例食品樣品的檢測，檢測結(jié)果與常規(guī)培養(yǎng)法基本一致[2]。該方法簡單、快速，但有時會受到樣品中非特異性熒光的干擾影響結(jié)果，且熒光顯微鏡較昂貴。

1.1.2 免疫酶技術(shù)（EIA）

免疫酶技術(shù)是利用酶標(biāo)記抗體或抗原，來檢測相應(yīng)抗原或抗體的一種免疫技術(shù)。目前用的較多的是酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）。該技術(shù)是使抗原或抗體吸附于固相載體上，加入酶標(biāo)記的抗體或抗原，再加入酶的底物，使反應(yīng)在固相載體上進行，酶和底物反映生成有色產(chǎn)物，有色產(chǎn)物的量與加入的抗原有關(guān)，根據(jù)產(chǎn)物顏色的深淺便可定量測定[3]。該技術(shù)具有速度快、靈敏度高、特異性強、準(zhǔn)確性好等特點。

1.2 食源性病原菌分子生物學(xué)快速檢測技術(shù)

1.2.1 基因探針技術(shù)

基因探針是指用同位素、生物素、地高辛等可檢測標(biāo)記的一小段已知序列的寡聚核苷酸。其原理就是通過分子雜交與目的基因結(jié)合，產(chǎn)生雜交信號，把目的基因找出來。探針標(biāo)記分同位素和非同位素兩種。同位素標(biāo)記探針的特異性強，檢測病原微生物的速度快。但同位素標(biāo)記因為放射性污染、核酸探針半衰期短，需要特別的安全防護，對人體有危害；受紫外線照射易分解；臨床標(biāo)本（如食品）中的內(nèi)源性生物素化蛋白質(zhì)和其它糖蛋白質(zhì)常引起背景加深和非特異性反應(yīng),所以在使用中受到一定限制。非同位素標(biāo)記剛好解決了這些問題。

1.2.2 多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)

PCR技術(shù)是指體外酶促合成特異DNA片段的一種技術(shù)，由高溫變性—低溫退火（復(fù)性）—適溫延伸形成一個循環(huán)周期，使目的DNA迅速擴增。PCR技術(shù)可將研究的目的基因或DNA片段在幾小時內(nèi)擴增到十萬至百萬倍，用肉眼就能直接觀察到。大大縮短了檢測時間，幾小時便可以完成。在一定程度上解決了核酸探針存在的問題。具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時、易自動化等特點。因此PCR檢測技術(shù)在食品安全檢測中得到了廣泛的應(yīng)用，如檢驗糧食、食品、花果是否安全，是否含有危險或潛在的病原微生物等。

1.2.3 生物芯片技術(shù)

又可稱作DNA微陣列（DNA microarray）。

生物芯片技術(shù)指由按照預(yù)定的位置固定在固相載體上很小面積內(nèi)的千萬個核酸分子（CDNA分子、寡核苷酸分子等）所組成的微點陣陣列。首先把樣品中的核酸片段進行標(biāo)記，在一定條件下，來自樣品的互補核酸片段可以與載體上的核酸分子雜交，在專用的芯片閱讀儀上就可以檢測到雜交信號。基因芯片技術(shù)實際上是高度集成化的反向斑點雜交技術(shù)，它解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交自動化程度低、操作復(fù)雜、檢測目標(biāo)分子數(shù)量少、成本高、效率低、結(jié)果客觀性差等問題[4]。但該技術(shù)由于芯片制作的復(fù)雜、樣品制備和標(biāo)記復(fù)雜，所以在食品微生物檢測中還沒有廣泛的應(yīng)用，因此在病原微生物檢測中具有很好的發(fā)展前景。

1.3 生理生化代謝產(chǎn)物的檢測技術(shù)

1.3.1 電阻抗法

電阻抗法的原理是細菌在生長的過程中，能將大分子物質(zhì)降解成活躍帶電的小分子，通過測定阻抗微弱的電變化，便可測出相應(yīng)的細菌數(shù)量。該法快速、方便、靈活、可靠。

1.3.2 微熱量計法

微熱量計法是利用細菌生長時會產(chǎn)生熱量，根據(jù)熱量的變化來鑒別細菌。不同的細菌產(chǎn)生的熱量不同。該法快、便宜。

1.3.3 放射測量法

放射測量法是利用細菌生長時將碳水化合物分解產(chǎn)生CO2，根據(jù)這個原理把微量的放射性標(biāo)記物引入碳水化合物分子中，當(dāng)細菌生長時，會放出含有放射標(biāo)記的CO2，放射量與菌數(shù)成正比，可測定食品中的細菌。此法快速、準(zhǔn)確[5]。

1.3.4 接觸酶測定技術(shù)

接觸酶測定技術(shù)的原理是通過計算一個含有接觸酶的紙盤，在盛有H2O2的試管中根據(jù)漂浮時間來估計菌數(shù)。接觸酶與H2O2發(fā)生反應(yīng)放出氧氣，樣品接觸酶陽性細菌含量越高，放出的氧氣越多，紙盤上浮的時間越短；反之，紙盤上浮的時間就越長。接觸酶多數(shù)腐敗微生物是嗜冷性細菌，多數(shù)嗜冷細菌接觸酶呈陽性，所以可以用接觸酶反應(yīng)來測定食品中的嗜冷性細菌。

1.4 現(xiàn)代化儀器對食源性病原菌的自動化檢測技術(shù)

1.4.1 ATB Expression細菌鑒定及藥敏智能系統(tǒng)

該系統(tǒng)是用于細菌快速鑒定的主要儀器。能鑒定常見的腸道菌、非腸道革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌以及厭氧菌外，還可鑒定單核增生李斯特菌在內(nèi)的6種李斯特菌、空腸彎曲在內(nèi)的18種彎曲菌蠟樣芽孢桿菌、炭疽桿菌在內(nèi)的24種需氧芽孢桿菌、淋球菌在內(nèi)的10種奈瑟菌和嗜血桿菌、52種乳酸桿菌等，可見其實用范圍的廣泛。該技術(shù)結(jié)果準(zhǔn)確、菌廣、速度快、輕松、靈活方便、成本低廉。

1.4.2 全自動微生物快速鑒定儀器VITEK

該系統(tǒng)是目前世界上最先進、自動化程度最高的細菌鑒定儀器。可鑒別405種細菌。它有高度的特異性、敏感性和重復(fù)性，操作簡便、檢測速度快，絕大多數(shù)細菌的鑒定檢測時間在2 h～18 h。

1.4.3 全自動微生物總數(shù)快速測定儀器（又名ATP熒光儀）

該儀器是專門用于快速檢測微生物數(shù)量的測定儀器，簡單實用，能快速和方便得到微生物的增長水平，及時采取有效措施控制微生物的繁殖，從而可以有效防治微生物大量繁殖引發(fā)的一系列問題。

1.5 食源性致病菌生物傳感器檢測技術(shù)

生物傳感器是一種含有固定化生物物質(zhì)如酶、抗體、細胞、細胞器或復(fù)合體等與一種合適的換能器緊密結(jié)合的分析工具或系統(tǒng)，用以將生化信號轉(zhuǎn)化為電信號并使其數(shù)量化。食源性致病菌生物傳感器檢測技術(shù)就是利用致病微生物在呼吸過程中產(chǎn)生電子的生物傳感器，產(chǎn)生電流，而電流的大小與測定液中微生物濃度有關(guān)，從而測定出微生物致病菌的含量。比如：大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和蠟樣芽孢桿菌都是常見的病原菌，用這種方法檢測，只需幾分鐘，檢出限為0.1ng/mL～1ng/mL，可以用于細菌毒素、真菌毒素的檢測。

2 現(xiàn)代食品微生物檢測技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用

食品安全有廣義和狹義兩種概念，廣義的食品安全內(nèi)容包括衛(wèi)生安全、質(zhì)量安全、數(shù)量安全、營養(yǎng)安全、生物安全、可持續(xù)性安全六大要素，狹義的食品安全指衛(wèi)生安全[6]。本文主要就是指衛(wèi)生安全方面的應(yīng)用。食品安全是遍及全球公共衛(wèi)生安全的重大問題，食品污染和食源性疾病在發(fā)達國家和不發(fā)達國家均普遍存在，發(fā)病率持續(xù)增高，且新的病原體感染不斷出現(xiàn)。據(jù)調(diào)查與任何一類疾病相比，由病原微生物引起的食源性疾病是危害最大的一類。而食品微生物檢驗是衡量食品安全質(zhì)量的一個重要指標(biāo)，也是判定被檢食品能否食用的科學(xué)依據(jù)，所以要求及時準(zhǔn)確的檢測出食品中的病原微生物。

2.1 食源性病原菌免疫學(xué)檢測技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用

免疫學(xué)檢測技術(shù)的儀器裝置相對造價低廉，操作簡便，實用性強。在食品微生物檢測方面已得到普遍使用。如常見的污染食品病源細菌：沙門氏菌、李斯特菌、大腸桿菌、葡萄球菌以及所產(chǎn)生的毒素；真菌中的黃曲霉素；食源性寄生蟲等的檢測。

2.2 核酸探針技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用

用核酸探針可以快速檢測李斯特菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀菌等。如檢測單增李斯特菌，可以不受待測樣純度的影響，直接進行檢測。Fillal等從染色體序列和質(zhì)粒中分離出檢測沙門氏菌的探針。該技術(shù)比較復(fù)雜，費用高，很多只能在實驗室進行。

2.3 多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用

PCR技術(shù)具有快速、特異性強、敏感度高等特性，在食品致病菌檢測方面具有廣闊的應(yīng)用前景。可以檢測食品中的沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增多性李斯特桿菌等。比如：Fu等[7]采用免疫磁珠法和實時熒光定量PCR技術(shù)結(jié)合不經(jīng)富集培養(yǎng)即可準(zhǔn)確、快速檢測出大腸埃希氏菌O157：H7，Berrada等[8]定量檢測出色拉中的李斯特菌。翁文川等[9]利用FQ－PCR技術(shù)對31株不同菌株的檢測中發(fā)現(xiàn)，有8株副溶血弧菌為陽性，而其另外23珠菌株為陰性。張霞等[10]通過實時熒光PCR檢測到了奶粉中坂崎腸桿菌

2.4 生物芯片技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用

生物芯片可在一次性實驗中檢出多種潛在的致病菌，可以對食品中的致病菌實行高通量的檢測，一次實驗即可得出全部的檢測結(jié)果，操作簡單、快捷、特異性強、敏感性高，全部檢測在幾小時內(nèi)就可完成。比如，張偉等將15種細菌16srDNA用引物擴增后與芯片上的探針雜交可以直接檢測食品中的致病菌，且只需6 h。但由于芯片的復(fù)雜性，大多數(shù)處于試驗階段，還沒有得到廣泛應(yīng)用。

2.5 生物傳感器檢測技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用

污染食品的微生物種類很多，主要包括細菌、真菌和病毒，其中以細菌最為常見。污染食品的微生物分為腐敗菌和病原菌，腐敗菌本身不致病，主要通過對食品成分的分解和破壞，產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)從而多人體造成危害。而生物傳感器檢測技術(shù)能快速檢測微生物比如：釀酒酵母、乳酸菌、枯草芽孢桿菌等常見的食品腐敗菌的數(shù)量；病原菌如：大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、和蠟狀芽孢桿菌等污染食品的病原菌；生物毒素比如：細菌毒素、藻類毒素、真菌毒素、以及其它毒素的檢測。特別是黃曲霉毒素B1（AF B1）是目前所發(fā)現(xiàn)的毒素最強的真菌毒素，通過光纖免疫傳感器來測定花生和玉米粉可得低達0.05μg/L的AFB1。但該技術(shù)還未真正用于食品安全檢測。

3 現(xiàn)代食品微生物檢測技術(shù)在食品安全檢測應(yīng)用中的發(fā)展趨勢

現(xiàn)代食品微生物檢測技術(shù)最突出的特點就是依靠高新技術(shù)，大量采用儀器設(shè)備，更加注重快速、準(zhǔn)確、實用。食品微生物檢測儀器是食品檢測技術(shù)的載體，主要體現(xiàn)在微型化、低能化、功能專用化、一體化和成像化。現(xiàn)代食品微生物檢測技術(shù)與生物技術(shù)成果相結(jié)合，比如：核酸探針技術(shù)、PCR技術(shù)在微生物檢驗方面有廣泛的應(yīng)用。盡管現(xiàn)代食品微生物檢測技術(shù)在食品安全檢測中有一定的應(yīng)用，但很多的技術(shù)還沒有真正在食品安全檢測中使用。比如：生物芯片技術(shù)、生物傳感器。因此要完全把現(xiàn)代食品微生物檢測技術(shù)應(yīng)用到食品安全檢測中還有一個試驗和發(fā)展過程，還需繼續(xù)開發(fā)和完善。比如：核酸探針雜交與PCR聯(lián)合使用，若能克服兩者存在的易污染、產(chǎn)生的假陽性等問題。今后還應(yīng)該大力發(fā)展在線無損的食品微生物檢驗技術(shù)，那些破壞性的或侵入性的微生物檢測手段將逐步被淘汰，而無損的可以進行原位檢測的食品微生物檢測技術(shù)將越來越受到歡迎，如生物傳感器等。隨著科技的發(fā)展，更多微生物檢測技術(shù)會廣泛應(yīng)用于食品的檢測，對食品安全將會發(fā)揮更大的作用。

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