冰結構蛋白及其應用研究

樊凱凱，劉愛國，*，陳東，曾國江，王弘，馮秀月

（1.天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津300134；2.天津市大橋道食品有限公司，天津 300350）

冰結構蛋白（Ice Structuring Proteins，ISP）又稱為抗凍蛋白（anti-freeze proteins）或熱滯蛋白(thermal hysteresis proteins），它們是一組能阻止冰結晶形成，控制其生長，改變冰凍或自然生長過程中冰核與冰晶體的生長規律、生長速度、冰晶體形狀和大小，并能抑制重結晶的天然蛋白質。它們可以非依數性降低溶液的冰點，而對熔點的影響很小，從而使溶液的冰點和熔點之間出現一差值，該差值稱為熱滯活性（thermal hysteresis activity，THA）。ISP存在于動物（如昆蟲和魚類）、植物（如胡蘿卜、冬麥草、桃樹等）、細菌以及真菌中，可以在低溫下保護生物機體免受冷凍的損傷。

1 冰結構蛋白的分類

從20世紀70年代首次從魚類的血液中提取出冰結構蛋白以來，經過幾十年的研究發展，人們相繼從植物，昆蟲，細菌，真菌中發現了具有同樣功能的蛋白質，它們在組成和結構上各不相同，并在基因序列上也沒有同源性，從而造就了冰結構蛋白的多樣性和復雜性。

1.1 魚類中冰結構蛋白的分類

魚類中冰結構蛋白主要分為6大類，分別是ISGP（Ice Structuring GlycoProtein）、ISPⅠ、ISPⅡ、ISPⅢ、ISPⅣ、Hyperactive-ISP。

1.1.1 ISGP

ISGP是從南極Trematomus borchgrevinki血清中分離得到的，由[-Ala-Ala-Thr-雙糖單位-]以不同的重復度串聯形成的多聚物，其中雙糖是葡萄糖-N-乙酰半乳糖。其分子量在2.6 ku～33.7 ku之間。分子量越大活性越高。糖基是其起作用的主要集團[1]。通過對糖基進行乙酰化或過氧化等化學修飾后，其活性喪失，并有報道稱其結構是一種與多聚脯氨酸Ⅱ相似的左手螺旋，并且其雙糖疏水基團面向碳骨架，而親水基團面向溶液[2]，以此結構來發揮活性。

1.1.2 ISPⅠ

ISPⅠ是從冬季比目魚和杜父魚中純化出來的一種蛋白質，它的分子量一般在3.3 ku～4.5 ku之間，是11個[-Thr-X2-Asx-X7-]氨基酸殘基的重復單元，其中X一般代表Ala，在ISPⅠ中Ala的含量高達60%。ISPⅠ的二級結構都是α-螺旋，三級結構為單一的α-螺旋[3]形成的球狀結構。冬季比目魚和杜父魚產生的ISPⅠ還包括兩個亞型：肝臟型ISPⅠ（liver-type winter flounderISPⅠ）和皮膚型ISPⅠ（skin-type winter flounder ISPⅠ）。肝臟型ISPⅠ是由肝臟細胞分泌的，因其含信號肽，所以可以分泌到血液中，發揮作用；而皮膚型ISPⅠ是由皮膚等與環境直接接觸的組織細胞分泌的，不含信號肽。因此，只能在細胞內發揮作用，并且肝臟型ISPⅠ的活性是皮膚型ISPⅠ的2倍。

1.1.3 ISPⅡ

ISPⅡ首先是從太平洋鯡魚（Clupea pallas）血清中發現的，隨后又在日本胡瓜魚以及海渡鴉中發現，它的分子量在11 ku～24 ku之間，是魚類ISP中分子量最大的一類[4]。它的一級結構的氨基酸排列中富含半胱氨酸，因此二硫鍵居多。二級結構中包含2個α-螺旋，2個β-折疊，并含大量的無規則卷曲。三級結構為球狀蛋白。ISPⅡ是唯一一種與已知蛋白質（凝集素C）有同源性的ISP[5]。太平洋鯡魚和日本胡瓜魚中的ISPⅡ的冰結合位點與凝集素C的糖結合位點同源，其活性和穩定性需要Ca2+存在，而海渡鴉中的ISPⅡ的冰結合活性與Ca2+無關。

1.1.4 ISPⅢ

ISPⅢ是從Zoarcoid科的魚類（Ocean Pout美洲大綿鳚）中分離出來的。它的分子量在6.5 ku～14 ku之間。它的一級結構中既不富含丙氨酸也不富含半胱氨酸，二級結構主要有9個β-折疊組成，其中8個組成了三明治夾心結構，另外1個游離在外。在這種三明治夾心結構中，3個串聯的β-折疊以“川”字排列，與另外3個串聯的β-折疊反向平行，剩余的2個則反向平行的分布于在“川”字外側[5]。三級結構是由9個β折疊相互作用形成的球狀蛋白。

1.1.5 ISPⅣ

ISPⅣ是從多刺床杜父魚（Myoxocephalus octode-cemspinosus）中分離出的一種ISP。其分子量大約為12.3 ku。一級結構包含108個氨基酸，N端連接了一個焦谷氨酰基團，其中谷氨酸含量可達17%。二級結構主要為4個α-螺旋。三級結構是由4個α-螺旋反向平行排列而成的螺旋束，疏水基向內、親水基向外發揮作用。ISPⅣ結構與膜載脂蛋白具有部分同源性[6]。

1.1.6 Hyperactive-ISP

Hyperactive-ISP是從冬季比目魚中發現的除ISPⅠ外的另一種冰結構蛋白。其分子量遠遠大于ISPⅠ，并且活性也高于ISPⅠ，它可以使冬季比目魚在-1.9℃下生存，而ISPⅠ只能使冰點降到-1.5℃[7]。冬季比目魚生活的極地海洋和北溫帶沿岸水域的冬季溫度一般在-1.9℃，因此，可以說是Hyperactive-ISP真正賦予冬季比目魚在-1.9℃的水域下生活的能力。

1.2 昆蟲中冰結構蛋白的分類

目前研究最多的昆蟲ISP基本都是從黃粉蟲（Tenebrio Molitor）、毛蟲（Dendroides Canadensis）、樅色卷蛾（Choristoneura Fumiferana）、美洲脊胸長椿（Oncopeitus Fasciatus）等4種昆蟲中分離純化的。昆蟲ISP是目前已知熱滯活性最高的ISP，可達5℃～10℃。

黃粉蟲ISP（Tenebrio Molitor ISP）的分子量為8.4ku，一級結構主要是由12個氨基酸（CTXSXXCXXAXT）的重復單元組成，富含蘇氨酸、半胱氨酸。二級結構主要是β-片層，三級結構在8個二硫鍵作用下形成7個螺周的右手β-螺旋結構。黃粉蟲ISP在毫摩爾濃度下的熱滯活性是魚類的10倍～100倍[8]。ISP可降低黃粉蟲血淋巴的冰點至-5℃，若與高濃度的甘油一起作用可降低冰點至-14℃。

毛蟲 ISP（Dendroides Canadensis ISP）包含 DISP-1、DISP-2兩種亞類，其相對分子質量約為8.7 kDa，分別含有83、84個氨基酸殘基。一級結構是7個含12或13個氨基酸殘基（CTXSXXCXXAXTX）的重復序列，含半胱氨酸15.9%。二級結構是46%β-折疊、39%β-轉角、2%螺旋、13%無規則卷曲。三級結構是由16個半胱氨酸形成八對二硫鍵的相互作用而形成。用DTT（二硫蘇糖醇）處理毛蟲ISP，可破壞某些二硫鍵，從而使其失去生物活性。也正是由于二硫鍵的存在，賦予其耐受100℃高溫的特性[9]。

樅色卷蛾 ISP（Choristoneura Fumiferana ISP）包含多種同型冰結構蛋白。其分子量在9.0 kDa左右，其結構是左手β-螺旋，每螺周的結構是包含15個氨基酸殘基形成的三角形結構，三角形的邊是β-折疊，其中Thr-X-Thr重復出現，富含蘇氨酸和半胱氨酸。樅色卷蛾ISP的抗凍活性是魚類ISP的3～4倍。樅色卷蛾ISP同型冰結構蛋白中的CFISP-501比其他樅色卷蛾ISP多出30或31個氨基酸殘基，即多出兩個螺周，而形成兩個額外環，有報道稱正是由于多出的兩個環，其與冰晶的結合更加嚴密，而使其抗凍活性是魚類ISP的10倍～100倍。

1.3 植物中冰結構蛋白的分類

植物中冰結構蛋白的研究比較晚，但是其來源廣泛易得，如胡蘿卜，女真葉，冬小麥等都可提取冰結構蛋白，并且植物性的冰結構蛋白在應用中也容易為人們所接受，因此對植物性冰結構蛋白的研究越來越多，如江南大學的黃衛寧等主要就是研究植物性冰結構蛋白的提取以及在冷凍面食中的應用。植物的冰結構蛋白的抗凍活性不高，熱滯活性略低于極地魚類的冰結構蛋白活性。

胡蘿卜ISP包含322個氨基酸殘基，分子量為36.8 ku。一級結構富含亮氨酸，N端帶有糖基化。二級結構包含24個氨基酸形成的兩個β-折疊和一個螺旋，從而形成了三級結構的有規律的右手β-螺旋的糖蛋白。pI=5.0，其熱滯活性為0.35℃。用相應酶切除糖鏈分子不影響重結晶抑制活性，從而表明糖鏈不是其主要的活性部位。

黑麥草（Olium perenn）ISP是由118個氨基酸殘基相互作用形成的，分子量為13 ku。一級結構由14或15個氨基酸重復單元組成。二級結構是重復序列組成的一個環，總共8個環。三級結構是8個環形成的β-筒狀結構，一端是纈氨酸組成的疏水區域，另一端是天冬酰胺組成的親水的區域。糖基化或去糖基化不影響黑麥草ISP與冰晶的結合，也就是說不影響黑麥草ISP的生物活性，并且黑麥草ISP能夠耐受高溫，在100℃下結構和活性穩定[10]。

沙冬青中可能包含多種ISP，分子量分別為67、21、50、37.1、28ku。熱滯活性分別為 0.46℃（10 mg/mL）、0.45 ℃（10 mg/mL）、0.35 ℃（5 mg/mL）、0.24 ℃（5 mg/mL）、0.15℃（10 mg/mL）。前兩種不是糖蛋白。其中50 ku ISP中含11%的α-螺旋、34%β-折疊、55%無規則卷曲。由這些ISP共同作用一起發揮其抗凍活性。

桃樹皮中含有具有脫水素蛋白的PCA60，分子量50 ku，含有472個氨基酸殘基，其中富含賴氨酸和甘氨酸，熱滯活性為0.06℃～0.09℃，具有較強的冰晶修飾能力。

1.4 細菌中冰結構蛋白的分類

細菌中分離提純冰結構蛋白的研究很少。從南極洲的細菌中有6種細菌可分離出ISP，從菌株Moraxella分離出的ISP為脂蛋白，是第一次報道的冰結構脂蛋白[11]；E.coli的ISP分子量大約為7.4 ku，稱為CS74，含大量的親水基團；研究者還在加拿大北極地區的一種根瘤菌（Pseudomonas putida GR12－2）中發現了一種冰結構蛋白。

1.5 真菌中冰結構蛋白的分類

真菌中冰結構蛋白的研究也非常少，有報道稱冬菇（Flammulina velupites）和牡蠣菇（Pleurotus ostreatus）中存在冰結構蛋白。

2 冰結構蛋白抗凍機制的研究

冰結構蛋白主要通過熱滯效應、重結晶抑制效應來發揮它的抗凍活性。熱滯效應是指冰結構蛋白可以非依數性的降低溶液的冰點，而對其熔點基本沒有影響，從而使冰點與熔點之間出現一差值，這個差值的大小就反映了冰結構蛋白的熱滯活性，差值越大活性越高。重結晶抑制效應是指冰結構蛋白可以抑制冰晶重結晶，而重結晶是指由于溫度波動，已形成的冰晶顆粒進行重新分配，大的冰晶越來越大，小的越小。

由于目前發現的冰結構蛋白種類繁多，基因和結構基本沒有同源性，并且分子量大小相差很大，就是從同一物種提出的冰結構蛋白相差也很大，所以造成它的抗凍機制的復雜性。目前公認的抗凍機制有吸附抑制模型、結構互補模型、晶格匹配模型、晶格占有模型、偶極子—偶極子模型、空間屏障學說等。

吸附抑制模型：這種模型是1977年Raymond[12]和DeVries提出的，他們認為冰結構蛋白可以吸附到特異的冰晶c軸表面，通過Kelvin效應抑制α軸方向上的生長，從而阻止冰晶生長，修飾冰晶形態。機制的模型是：一般晶體的生長垂直于晶體表面，假如雜質分子吸附于冰生長的表面，那么需要再外加一推動力（冰點下降），促使冰能在雜質間生長。新加坡國立大學Du[13]等人首次從數量上檢測冰結構蛋白的抗凍機制，他們發現冰結構蛋白可以吸附到小晶核和塵埃顆粒上，從而抑制冰晶的成核作用。這為吸附抑制模型提供了有力的證據。但是吸附抑制模型不能完整的解釋冰結構蛋白抑制冰晶生長的機理，因此,還有待進一步的完善。

結構互補模型：該模型于2002年由Jia[14]等提出，也稱為“受體—配體模型”，其中冰結構蛋白是受體，冰晶是配體。冰結構蛋白表面與冰晶表面之間主要通過不可逆的疏水作用以及范德華力（也包含部分氫鍵，但是次級作用力）互相吻合，而發揮抗凍活性。加拿大阿爾伯達大學研究人員發現甲蟲冰結構蛋白中的規則的蘇氨酸排列以最適方式與冰晶表面緊密咬合，排除了水與冰晶的接觸，從而抑制冰晶生長。這為結構互補模型提供了有力的證據。進一步證實結構互補模型的證據是[15]，2002年北京師范大學與加拿大皇后大學生化系的研究人員首次將分子軌道計算法應用于冰結構蛋白ISP-Ⅱ，檢測到ISP-Ⅱ中的19個氨基酸殘基可與冰晶表面相吻合。

其他模型有，1983年由Deviles提出的晶格匹配模型，隨后于1988年，Yang等提出的偶極子—偶極子模型，Knigh于1993年在晶格匹配模型的基礎上提出了晶格占有模型。但由于魚類、昆蟲、植物、細菌能夠耐受寒冷不只是與冰結構蛋白有關，它還與組織中的一些抗凍因子有關，從而使其抗凍機制更加復雜多樣，因此需進一步的探討它的抗凍機制。

3 冰結構蛋白作為食品添加劑的安全性研究

每種新型蛋白作為食品添加劑，應用于食品之前都要對其潛在的危險進行研究，如過敏性等。盡管冰結構蛋白應用于食品中具有巨大的商業價值，但其過敏性也同樣帶來了爭議。Bindslev[16-17]等研究了冰結構蛋白的過敏性，他們主要從三方面來闡述。其一，對冰結構蛋白進行氨基酸序列分析。通過BLAST（局部序列比對基本檢索工具）和PIR-NREF（蛋白質信息庫）軟件測序，與已知的過敏原序列進行比對，發現其與已知過敏原無同源性；其二，過敏原對胃蛋白酶的抗性分析。通過 RP-HPLC、SDS-PAGE、GFC、LC-MC 等方法對冰結構蛋白進行研究，發現通過HPLC或SDSPAGE，冰結構蛋白的生物活性在4 min后下降了一半；其三，平時人體血液中的免疫球蛋白E（IgE）的含量很少以及嗜堿性粒細胞不會釋放組胺，當有過敏物質存在時，會誘導產生過敏反應，從而使IgE含量增加，釋放組胺，因此，通過檢測血液中IgE含量和組胺含量，可以判斷該物質是否為過敏原。Bindslev等在添加ISP后，通過Maxisorp RAST（放射免疫吸附法）測定血液中IgE含量不會超過200μg/mL，組胺沒有釋放。因此通過上述三方面實驗，可以斷定ISP不會引起過敏反應，是一種安全的食品添加劑，可以放心使用。

4 冰結構蛋白的應用

4.1 冰結構蛋白在食品中的應用

冰結構蛋白作為一種新型的食品添加劑，比較成功的應用于冰淇淋、冷凍面團、肉制品等食品中，它可以有效地抑制冰晶生長，并抑制重結晶，從而提高食品的質量，減少營養的流失。

4.1.1 冰結構蛋白在冰淇淋中的應用

有資料顯示，隨著生活節奏的加快，高中檔冰淇淋和雪糕的銷量呈明顯上升的趨勢，而冰淇淋由于其口感細膩滑潤，冰甜可口，色澤鮮艷，味道宜人，現在越來越受到人們的親睞，并且冰淇淋的樣式也越來越多，市面上的種類也是五花八門，像哈根達斯和意大利的軟式冰淇淋，但是所有的冰淇淋產業仍面臨的問題是如何減小冷凍過程中冰晶的生長和重結晶，尤其是中低端的冰淇淋。而隨著冰結構蛋白的研究使人們看到了希望，通過研究發現ISP可以與冰晶表面結合而阻止冰結晶形成，控制其生長，改變冰凍或自然生長過程中冰核與冰晶體的生長規律、生長速度和冰晶體形狀和大小，并能抑制重結晶，從而避免產生大的冰晶而影響口感，并可提高其穩定性。我國于2006年首次在食品安全國家標準GB2760上公布冰結構蛋白可以以新的食品添加劑添加到冷凍食品中。在國際上目前只有聯合利華公司將冰結構蛋白應用于冰淇淋中，發現冰結構蛋白添加到冰淇淋中可以消除冰渣，而改善質量和口感[18]。其他外國公司還沒有研究使用，因此，冰結構蛋白在冰淇淋中的應用前景廣闊。

4.1.2 冰結構蛋白在中式冷凍面團中的應用

在國內，江南大學黃衛寧等主要研究冰結構蛋白在中式冷凍面團中的作用。冷凍面團技術是一門新的烘焙食品加工技術，面團經過長時間的冷藏，面團的品質會下降，如醒發時間延長，比容減小等。而研究發現[19]，與空白樣對比，添加0.5%ISP的面團可以有效的縮短面團的醒發時間，增大面包比容而減小面包硬度。并經過掃描電鏡實驗，發現添加0.5%ISP的冷凍面團，經長時間凍藏后，仍然可以觀察到明顯的面筋網絡結構，這說明ISP可以顯著保護冷凍面團超微結構。

4.1.3 冰結構蛋白在肉制品中的應用

肉制品經過反復冷凍，由于冰晶不斷集聚變大，會對肉制品的組織產生破壞，從而使汁液外漏，營養流失。而加了ISP的肉制品或者在宰殺前24 h將0.01 mg/mL的ISP注射入待宰羔羊體內，均可有效地減少滲水和冰晶的形成，從而保持其原有的組織結構，減少營養流失[20]。可能是因為ISP使部分融化的冰晶緩慢地滲入到細胞內，在蛋白質顆粒周圍重新形成水化層，使汁液流失減少，保持解凍食品的營養成分和原有風味。

4.2 冰結構蛋白在農業中的應用

1998年英國York大學Worrall首次發現了植物的ISP基因[21]，2001年尹明安等成功克隆出了胡蘿卜的ISP基因。隨著各種ISP的基因測序的進行，研究者通過基因工程技術將ISP的基因導入植物體內，并在體內表達，使植物獲得抗凍活性，選育出轉基因的抗凍植物，擴大了植物的種植范圍，打破了植物因寒冷或霜凍等氣候而限制了產地和產量。

4.3 冰結構蛋白在醫學中的應用

冰結構蛋白能夠保護移植的人體器官免受運輸過程中因溫度的上下波動而生成的冰晶對器官的破壞，并能延長移植器官的壽命，從而為移植手術爭取更長時間。

冰結構蛋白還可作為定向藥物運輸到腫瘤細胞附近，然后控制冰晶生長，從而可定向的冰結和破壞皮膚中的腫瘤細胞，而減少對周圍細胞和組織的損傷。

5 展望

上述介紹了冰結構蛋白的分類、抗凍機制、安全性以及在各行業的應用。盡管對冰結構蛋白已經有了很深的研究，并且也認識到了冰結構蛋白具有較高的潛在應用價值，但是不同原料、不同方法研究的絕大多數冰結構蛋白從實驗研究到實際生產還面臨很多問題，尤其是研究結構與功能之間的關系和如何能更好地實現冰結構蛋白的產業化等。然而，可以預見的是，隨著科技力量的發展及科研工作的不斷深入和研究者的不斷努力，冰結構蛋白必將實現規模化，并會應用到各個領域，為提高速凍食品的品質、生產過程中的節能降耗提供較好的支撐條件。

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