凋亡抑制蛋白Livin在上尿路移行細胞癌中的表達及其與預后的關系

吉日嘎拉，王 璠，余大海，鮑阿珉，烏云畢力格，王超奇，王 明，哈申高娃

（內蒙古民族大學附屬醫院1.泌尿外科；2.蒙醫血液腫瘤科，內蒙古 通遼 028000）

凋亡抑制蛋白Livin在上尿路移行細胞癌中的表達及其與預后的關系

吉日嘎拉1，王 璠1，余大海1，鮑阿珉1，烏云畢力格1，王超奇1，王 明1，哈申高娃2＊

（內蒙古民族大學附屬醫院1.泌尿外科；2.蒙醫血液腫瘤科，內蒙古 通遼 028000）

目的 檢測Livin蛋白在人正常膀胱組織及上尿路移行細胞癌組織中的表達情況，并分析其表達與腫瘤臨床分期、病理分級及腫瘤復發之間的關系。方法采用免疫組織化學法檢測12例正常上尿路上皮組織切片及58例上尿路移行細胞癌組織標本及中Livin基因的表達情況。結果Livin蛋白在正常上尿路上皮組織中無表達，而在移行細胞癌組織中高表達，陽性表達率為60.3%。Livin蛋白在不同性別、年齡及是否伴有淋巴結轉移患者中的表達差異無統計學意義（P＞0.05），而不同分期及分級的組間表達差異具有統計學意義（P＜0.05）。隨訪9-45個月（平均29.3個月），腫瘤患者中共有27例出現局部或膀胱復發，總復發率為46.6%，其中Livin表達陰性組3年估計無瘤復發生存率為49.5%，而Livin表達陽性患者3年估計無瘤復發生存率為30.1%，二者之間差異顯著（P＝0.04）。結論Livin在正常上尿路移行上皮組織中不表達，在上尿路移行細胞癌組織中高表達，Livin的表達與上尿路移行細胞癌分期、分級密切相關，與腫瘤復發密切相關。

Livin基因；上尿路移行細胞癌；免疫組化；腫瘤復發

（ChinJLabDiagn，2012，16：1845）

上尿路移行細胞癌是泌尿系統常見腫瘤性疾病，包括腎盂癌及輸尿管癌，在所有成人腎臟腫瘤中占5%-10%［1］，治療金標準為根治性腎輸尿管切除術，術后需給予膀胱內化療藥物灌注預防腫瘤膀胱復發，但療效并不確切，文獻報道術后膀胱內復發率約為10%-55%［2，3］。因此，如何預防上尿路移行細胞癌術后復發成為人們研究的主要目標。近年來，關于上尿路移行上皮癌相關基因研究已成為熱點，凋亡抑制基因可以抑制腫瘤細胞凋亡來促進腫瘤生長。而Livin基因是新近發現一種凋亡抑制基因，本研究通過檢測上尿路移行細胞癌組織中Livin基因的表達情況來探討其與腫瘤臨床分期、病理分級及腫瘤復發之間的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取內蒙古民族大學附屬醫院泌尿外科2007年1月-2011年1月行手術治療的上尿路移行細胞癌患者的石蠟切片。排除標準：①病理證實非上尿路移行細胞癌；②既往有其他系統惡性腫瘤病史。58例患者最終進入本研究，其中男性31例，女性27例，平均年齡62.7歲。根據2002年AJCC上尿路移行細胞癌TNM分期標準進行腫瘤分期：Ta期11例，T1期17例，T2期23例，T3期5例T4期2例。腫瘤分級采用1973年 WHO標準：G1級21例，G2級26例，G3級11。其中淋巴結轉移5例，無遠處轉移病例。正常上尿道上皮組織切片來自上尿路良性疾病，共12例。

1.2 主要試劑UltraSensitiveTM SP超敏試劑盒及DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術有限公司），山羊抗人Livin抗體（美國R＆D公司，）辣根酶標記的兔抗山羊二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3 免疫組化免疫組化步驟按試劑盒要求進行。以PBS代替一抗作陰性對照，以試劑盒陽性片作為陽性對照。

1.4 結果判定Livin基因陽性表達結果定位于細胞胞質中。由兩名觀察者對所有切片進行雙盲判斷。當細胞胞質中出現棕黃、淺黃或棕褐色小顆粒時定義為陽性表達。根據著色強度的差異來記錄分數：無著色：記0分，淺黃色：記1分，棕黃色：記2分，棕褐色：記3分。隨機觀察5個高倍視野，記錄以上5個高倍視野中染色陽性細胞的平均百分率，記分標準如下：0%記0分，1%-10%記1分，11%-40%記2分，51%-70%記3分，＞70%記4分。染色強度記分結果與陽性細胞數記分之積為最后得分：0－1分為陰性，＞1分為陽性。以PBS代替一抗作為陰性對照

1.5 隨訪隨訪內容包括胸片，血常規、腎功能，尿脫落細胞，膀胱鏡，CT等。術后一年內每3個月隨訪一次，第二年開始每半年一次。

1.6 統計學分析率的比較采用χ2檢驗，3年估計無瘤生存率采用Kaplan-Meier生存曲線計算，log-rank檢驗比較生存曲線。P＜0.05認為有統計學意義。應用SPSS10.0統計軟件進行分析。

2 結果

2.1 細胞漿呈黃色至棕褐色為Livin蛋白陽性表達（圖1） 58例患者中Livin表達陽性35例，陽性率為60.3%。12例正常上尿道移行上皮組織中無表達。

圖1 Livin基因在膀胱癌中表達（A：PBS對照；B：陽性表達）

2.2 Livin蛋白在不同腫瘤分期、分級及淋巴結轉移患者中的表達

Livin蛋白在不同性別、不同年齡組（以50歲為界將分為兩組）患者中的表達的差異無統計學意義（P＞0.05）。Ta陽性表達2例，T1陽性表達10例，T2陽性表達18例，T3陽性表達4例，T4陽性表達2例。各臨床分期組別中Livin蛋白表達差有統計學意義（P＜0.05）。G1級患者中陽性表達8例，G2陽性表達19例，G3陽性表達8例，組間差異有統計學意義（P＜0.05）。在伴有淋巴結轉移組與無淋巴結轉移患者組的比較中，Livin基因的表達的差異無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

表1 Livin蛋白在不同分級、分級及淋巴結轉移患者中的表達情況

2.1 Livin蛋白表達與腫瘤復發之間的關系

術后平均隨訪時間29.3（9-45）個月，共有27例出現腫瘤膀胱復發、局部復發或遠處轉移，其中Livin表達陰性組中有8例復發，3年估計無瘤生存率為49.5%，Livin表達陽性35例患者中有19例復發，3年估計無瘤生存率為30.1%，二者之間差異有統計學意義（（P＜0.05））（圖2）。

圖2 Livin表達陽性與陰性兩組患者無瘤生存率比較

3 討論

Livin位于人染色體20q13.3，包含7個外顯子，6個內含子，全長共46kb［4］，是近年發現的人類凋亡抑制蛋白家族中的一個新成員，有研究表明livin蛋白抑制細胞凋亡主要通過抑制caspas-3及caspas-9的生物活性，進而促進腫瘤細胞的增值［5－7］。livin基因在僅在少數成年人的心臟、胎盤、脾、卵巢、肺等正常組織低表達，而在前列腺癌、膀胱癌、腎癌、白血病黑色素瘤、肺癌、及頭頸部肉瘤等多種惡性腫瘤細胞中高表達［4，6－8］，目前，國內外文獻中關于Livin基因在泌尿系腫瘤中表達的研究主要集中于膀胱移行上皮癌，尚無針對上尿路移行上皮癌的研究報告［9］。

本研究使用免疫組織化學染色方法得到Livin在上尿路移行細胞癌中的表達陽性率為60.3%，而正常尿路上皮中不表達，與李顯文等采使用RTPCR法檢測膀胱移行上皮癌得到的66.6%的陽性率相近［10］。這表明Livin蛋白在移行上皮癌中高表達。此外，在不同病理分期上尿路移行細胞癌中Livin蛋白表達情況的比較中，我們發現：Livin基因的表達與上尿路移行細胞癌的分期及分級密切相關，即隨分級、分期增加，表達陽性率逐漸增加。但本研究中樣本中T3、T4期患者數量較少，且總樣本小，可能出現一定的偏倚。但我們的研究可充分提示Livin基因與上尿路移行細胞癌發生、發展密切相關，這表示Livin基因將來可能成為一項生物學指標來進行上尿路移行細胞癌的早期診斷。

國內、外多個Livin蛋白在膀胱移行細胞癌中表達的相關研究中，均未能完成通過對研究對象的隨訪來判斷Livin基因表達與腫瘤復發的關系。而Mesallamy等通過急性白血病患者Livin基因表達的檢測后認為在影響預后的相關因素分析中，Livin基因表達陽性是影響疾病預后的主要因素之一［11］。在本研究通過長期隨訪后發現共有27例患者出現腫瘤復發、轉移，總腫瘤復發率為46.6%。Livin基因表達陽性患者3年估計無瘤生存率顯著低于Livin表達陰性患者，我們可以認為Livin蛋白表達陽性與術后腫瘤的復發密切相關。因此，可通過檢測患者Livin基因的表達的情況來制定術后腫瘤輔助治療的具體方案及隨訪方案。

Wagener等通過Livin在腎臟腫瘤組織中的表達情況的研究后認為Livin基因可作為腎臟腫瘤治療的靶點［12］。Crnkovic等認為RNA干涉技術可以用來抑制Livin基因的表達而使腫瘤細胞凋亡明顯［13］。Purin等發現寡肽可以使Livin基因在腫瘤組織中的表達下調，促進腫瘤細胞的凋亡而達到治療腫瘤的目的［14］。以上研究結果表明Livin可以作為腫瘤生物治療的靶點，通過抑制Livin基因的表達來進行腫瘤的治療。由于Livin基因在上尿路移行細胞癌中表達率較高，因此可以通過多種方法抑制Livin基因表達的方法來減少Livin基因在上尿路移行細胞癌中的表達，加速腫瘤細胞的凋亡，達到治療腫瘤的目的，同時可用于術前腫瘤的降期及術后輔助治療。目前國內外相關報道相對較少，有待于進一步研究。

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The expression of Livin gene in upper urinary tract transitional cell carcinoma and its relation to the tumor relapse

JIRIGALA，WANGPang，YUDa-hai，etal.（1.DepartmentofUrology；2.DepartmentofMongolianHematology，AffiliatedHospitalofInnerMongoliaUniversityforNationalities，Tongliao028000，China）

ObjectiveTo assess the expression of Livin gene，a new member of the inhibitor of apoptosis protein family，in upper urinary tract transitional cell carcinoma（UTCC）and to indentified the relationship between tumor stage，tumor grade and relapse with its expression.MethodsImmunohistochemical staining for livin was performed using paraffin-embedded tissues from 58cases of UTCC and 12normal tissue of upper urinary tract.Disease-specific survival of patients was assessed，the differences between the immunohistologically livin-positive and livin-negative groups was compared with recurrence-free survival using the Kaplan-Meier method and log-rank test.ResultsOf the 58 UTCC specimens，35（60.3%）showed positive staining of Livin immunohistochemically.There is no expression in normal upper urinary tract tissues.The expression of Livin gene were statistically similar in different age，sex and lymph node metastasis status groups（P＞0.05）.Howerver，the positive expression rate of Livin gene of different tumor grade and stage groups showed a statistically difference（P＜0.05）.The mean follow up was 29.3months，the over all recurrence rate was 46.6%.For positive expression group，the 3-year estimate recurrence free survival rate was 30.1%，and 49.5%for the negtive expression group，the difference was significant（P＜0.05）.ConclusionLivin gene can be detected in UTCC tissues，and its expression is correlated with the tumor stage，grade and tumor relapse，it may be recognized as a biomarker of UTCC.

Livin gene；upper urinary tract transitional cell carcinoma；immunohistochemistry；tumor relapse

R737.1

A

1007－4287（2012）10－1845－04

＊通訊作者

2011－08－26）