一個(gè)獨(dú)特臨床表型的SPD家系HOXD13基因突變分析

劉淑文，郭忠輝，劉 蕾，宮立程，楊 光，楊 軍＊

（1.吉林省人口生命科學(xué)技術(shù)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130041；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 手外科）

一個(gè)獨(dú)特臨床表型的SPD家系HOXD13基因突變分析

劉淑文1，郭忠輝1，劉 蕾1，宮立程2，楊 光2，楊 軍2＊

（1.吉林省人口生命科學(xué)技術(shù)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130041；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 手外科）

＊通訊作者

先天性并指（趾）多指（趾）畸形（synpolydactyly，SPD）為Ⅱ型并指，典型的表現(xiàn)為手部3、4指并指和（或）足部4、5趾并趾，并伴有多指（趾）［1］。目前認(rèn)為非綜合征的SPD為常染色體顯性遺傳疾病，位于2q31的H0XD13基因是其致病基因。我們收集到一個(gè)3代的SPD家系，其中3例患者表現(xiàn)為三種變異的并指多指畸形。對(duì)該家系HOXD13基因突變的研究發(fā)現(xiàn)，此家系中患者均攜帶發(fā)生9個(gè)丙氨酸延展突變的HOXD13基因。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象一個(gè)位于中國(guó)吉林省內(nèi)連續(xù)3代發(fā)生SPD的家系（圖1）。先證者Ⅲ1就診于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院手外科門診，我們通過先證者父母進(jìn)行臨床及遺傳資料收集整理。該家系共3代6名成員，其中患者3人，均為男性患者，跨越3代并無(wú)隔代遺傳現(xiàn)象，符合常染色體顯性遺傳病特征。我們對(duì)3例患者進(jìn)行了臨床診斷，并拍攝了數(shù)碼照片和X線片（圖2）。

患者Ⅰ1（A、A′、B、B′）根據(jù)數(shù)碼照片和線片可以看出表現(xiàn)為輕微的臨床表型。Ⅱ1（C、C′、D、D′）表現(xiàn)為雙手的屈指畸形和關(guān)節(jié)粘連。Ⅲ1（先證者，E、E′、F、F′）數(shù)碼照片為兩次手術(shù)后，X線片為未手術(shù)前原始照片，表現(xiàn)為獨(dú)特的復(fù)指、橫向指骨及掌指骨融合

圖1 SPD家系圖

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增 經(jīng)患者及家屬知情同意后，采集家系成員外周血6份（10ml／人），同時(shí)抽取100名無(wú)關(guān)志愿者靜脈血液進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，其中男57名，女43名。之后采用TIANamp Blood DNA Kit提取基因組DNA，記錄DNA濃度后，EP管密封－4℃保存?zhèn)溆谩ＴO(shè)計(jì)引物擴(kuò)增HOXD13基因外顯子1和2。擴(kuò)增步驟為：預(yù)變性溫度為94度3分鐘，94度55秒，64度55秒，72度60秒，35個(gè)循環(huán)，最后延伸為72度10分鐘。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴乙錠染色后觀察條帶。

1.2.2 測(cè)序 使用相同的引物，測(cè)序儀器為ABI PRISM 3730，測(cè)序試劑為BigDye terminator v3.1，由北京華大基因生物公司測(cè)序部對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化及測(cè)序。將突變片段的測(cè)序結(jié)果與Genebank中HOXD13第1，2外顯子中該DNA序列進(jìn)行比較。

圖2 SPD家系雙側(cè)手足外形和X線片

2 結(jié)果

2.1 臨床特征該家系患者臨床表型為一個(gè)較寬泛的SPD表型譜。其中患者I1為較輕微的臨床表型，僅表現(xiàn)為左中、環(huán)指并指，伴有環(huán)指短指、小指屈曲畸形，X線片見環(huán)指近節(jié)、中節(jié)指骨發(fā)育畸形，且近位指間關(guān)節(jié)發(fā)育異常。右中、環(huán)指遠(yuǎn)節(jié)指骨輕度橈側(cè)偏斜。左足表現(xiàn)為第4、5足趾軟組織并指，右足未見異常。

患者Ⅱ1臨床表型較I1嚴(yán)重，雙手及雙腳均見異常。左2～5指屈曲畸形，且示指橈偏，中、環(huán)、小指尺偏，X線片環(huán)指掌指關(guān)節(jié)處見異常骨塊。右手較左手不同之處在于右手中、環(huán)指并指。患者雙足第4、5足趾并趾。

Ⅲ1（先證者）雙手曾進(jìn)行過兩次手術(shù)。左手畸形重于右手，中、環(huán)、小指并指，伴環(huán)指短指、橈偏畸形、小指屈曲畸形。X線片可見異常發(fā)育指骨、橫向指骨及掌指骨融合。右手表現(xiàn)為中、環(huán)指并指畸形。雙足第4、5足趾并指多指。

2.2 HOXD13突變分析

我們用PCR和擴(kuò)增PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，分析家系中3個(gè)患者、3個(gè)正常個(gè)體及100個(gè)對(duì)照個(gè)體基因型，發(fā)現(xiàn)該家系中3名患者HOXD13基因第1外顯子中存在重復(fù)突變（c.186-212dup），此突變導(dǎo)致HOXD13蛋白氮端結(jié)構(gòu)域多聚丙氨酸鏈延長(zhǎng)9個(gè)丙氨酸（圖3），而在家系中正常個(gè)體及100名對(duì)照無(wú)關(guān)志愿者中沒有發(fā)現(xiàn)異常。

圖3 反向引物進(jìn)行PCR產(chǎn)物測(cè)序峰圖

3 討論

先天性并指畸形（Syndactyly）是人類最常見的肢端畸形之一，發(fā)生率為1：2000～1：2500，特征表現(xiàn)為兩個(gè)或兩個(gè)以上手指及其相關(guān)組織成分先天性病理相連［2］。1978年 Tentamy和 McKusick［3］將并指畸形分為五種類型，其中Ⅱ型為并指（趾）多指（趾）畸形（SPD）。根據(jù)臨床表型的不同，SPD可分為典型表型、輕微表型和特殊表型［4］；而遺傳學(xué)上將SPD分為SPD1、SPD2和SPD3三種類型，分別定位于2q31，22q13.31 和 14q11.2－q12［3］。

HOX基因編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子超家族，在胚胎發(fā)育過程中起著重要的作用。HOX基因包括HOXA、HOXB、HOXC、HOXD4個(gè)基因簇，分別位于 不 同 的 染 色 體 上［5、6］，其 中 HOXD 位 于 2q31。HOXD13位于HOXD簇最5′端，有兩個(gè)外顯子，其中外顯子1包含一個(gè)不完全的三核苷酸重復(fù)序列，編碼一個(gè)由15個(gè)丙氨酸殘基組成的多聚丙氨酸片段［7］。目前研究發(fā)現(xiàn)HOXD13的7～14個(gè)多聚丙氨酸鏈延展突變可導(dǎo)致具有典型臨床表現(xiàn)的SPD1，而少于6個(gè)丙氨酸插入不能引起表型異常［8］。我們報(bào)道的這個(gè)家系中3名患者HOXD13基因第1外顯子中存在重復(fù)突變，此突變導(dǎo)致HOXD13蛋白氮端結(jié)構(gòu)域多聚丙氨酸鏈延長(zhǎng)9個(gè)丙氨酸，這和以往的研究一致。

對(duì)于SPD1的臨床表型與多聚丙氨酸鏈延伸的長(zhǎng)度是否相關(guān)存在爭(zhēng)議。Goodman等［9］搜集了20個(gè)聚丙氨酸延展突變的SPD家系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)突變基因在逐代傳遞過程中，家系內(nèi)部多聚丙氨酸鏈長(zhǎng)度雖然沒有發(fā)生改變，但是在家系之間進(jìn)行比較時(shí)，SPD表型的嚴(yán)重程度和外顯率隨著多聚丙氨酸鏈長(zhǎng)度增加而明顯增加。其中一個(gè)插入14個(gè)丙氨酸家系的患者都表現(xiàn)為嚴(yán)重的表型，手部畸形均累計(jì)指骨和腕部，男性患者中還出現(xiàn)了尿道下裂。2004年Albrecht等［10］通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PAE突變型HOXD13蛋白不能進(jìn)入核內(nèi)，而野生型蛋白可以順利進(jìn)入核內(nèi)行使功能，據(jù)此推斷隨著插入丙氨酸鏈長(zhǎng)度的增加，對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響也增大，阻礙其行使正常的功能，能夠說(shuō)明SPD獨(dú)特的臨床與遺傳異質(zhì)性。但是近年另一個(gè)對(duì)32個(gè)SPD1家系的調(diào)查研究表明SPD1基因型與表現(xiàn)型之間無(wú)明顯相關(guān)性［4］。

我們報(bào)道的這個(gè)HOXD13基因9個(gè)丙氨酸延展突變的家系患者表現(xiàn)為輕重不等的臨床表型。其中先證者Ⅲ1為特殊表型，表現(xiàn)為獨(dú)特的復(fù)指、橫向指骨及掌指骨融合，此之前的文獻(xiàn)中未見描述，其意義在于增加了HOXD13多聚丙氨酸延展突變可能引起的表型范圍，但尚需進(jìn)一步的研究探索此種變異的機(jī)制，解釋引起此表型異質(zhì)性的原因。

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［10］Albrecht AN，Kornak U，Boddrich A，et al.A molecular pathogenesis for transcription factor associated poly-alanine tract expansions［J］.Hum Mol Genet，2004，13（20）：2351.

1007－4287（2012）10－1863－03

吉林省財(cái)政廳科研項(xiàng)目基金（編號(hào)2060302）

2011－08－17）