一起O139群霍亂弧菌感染的病原學檢測分析

龔令旗

湖南省益陽市資陽區疾病預防控制中心，湖南益陽413001

霍亂是由一群和Ο139群霍亂弧菌引起以腹瀉為主要癥狀的甲類傳染病，在我國尤其是近幾年來因食用海水產品引起霍亂弧菌感染的事件逐年升高。為了查明霍亂疫情發生的原因，以及傳統的分離培養方法和膠體金快速免疫層析法的比較，2010年10月該市某村也發生一起因食用甲魚引起感染的霍亂疫情，經流行病學調查及實驗室病原檢測，證實是由霍亂弧菌Ο139群感染引起的，現將其病原學檢測情況報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

患者腹瀉物、家屬和部分聚餐人員的肛拭子共計33份，病家水缸水、井水以及患者購買甲魚的徐記水產品批發部處的甲魚、牛娃等海水產品及甲魚暫時養殖水共計25份。

1.2 實驗設備，檢測試劑及培養基

堿性蛋白胨，慶大霉素瓊指，微量生化鑒定管均購自杭州天和微生物試劑有限公司，霍亂弧菌Ο1群和Ο139群血清購自中國藥品生物制品檢定所，霍亂弧菌Ο1群和Ο139群膠體金快速檢測條購自北京莊笛浩禾生物有限公司。所有試劑及培養基均在有效期內使用，實驗室內質控和室間質評均符合要求。

1.3 方法

1.3.1 膠體金快速免疫層析試驗法 將霍亂弧菌Ο139群和Ο1群膠體金快速檢測條放置于潔凈干燥工作臺上，用吸管取患者腹瀉物，密切接觸者扛拭子增菌液以及相關甲魚的一二次增菌液各2～3滴，滴入檢測條加樣端15 min內觀察結果。

1.3.2 常規菌株分離 按《霍亂防治手冊》（5版）進行[1]患者腹瀉物、可疑者肛拭子直接接種10 mL堿性蛋白胨水中增菌6～8 h后，劃線接種慶大霉素瓊脂平板，井水和甲魚養殖水標本450 mL，調pH9.0加50 mL 10倍濃縮堿性胨水，以無菌方式采集甲魚內臟25 g接種225 mL堿性胨水，增菌6～8 h，劃線接種慶大霉素瓊脂平板分純培養，同時取0.1～0.2 mL表層培養物轉種10 mL堿性胨水作二次增菌后劃線接種慶大霉素瓊脂（36±1）℃培養18～24 h，挑取可凝菌落染色鏡檢。同時挑取慶大霉素瓊脂上中等大小露水狀半透明灰色菌落與Ο1群和Ο139群霍亂弧菌診斷血清做玻片凝集試驗，用生理鹽水作對照。同時分純菌落做生化反應鑒定，并將所分離的陽性菌株送省級疾控中心進行相關毒力基因的鑒定以確定其型別。

2 結果與分析

2.1 膠體金試紙條檢測結果

所有內外環境標本Ο1群霍亂弧菌膠體金快速試紙條結果全部陰性，除患者腹瀉物，1名密切接觸者徐記水產品批發處的甲魚內臟及該甲魚的養殖水的第二次增菌液等4份標本為Ο139群霍亂弧菌膠體金試紙條結果陽性外，其余均為陰性，見表1。

表14 株Ο139群霍亂弧菌檢測結果

2.2 常規法分離菌株的檢測結果

33份內環境標本中從患者腹瀉物和密切接觸者中分離出2株Ο139群霍亂弧菌，25份外環境標本中甲魚內臟及該甲魚養殖水分離出2株Ο139群霍亂弧菌，4株Ο139群霍亂弧菌陽性菌株均分解葡萄糖，麥芽糖，甘露醇，蔗糖，不分解阿拉伯糖，乳糖，賴氨酸脫羧酶陽性，鳥氨酸脫羧酶陽性，精氨酸脫羧酶陰性，氧化酶陽性，粘絲試驗陽性，有動力，0%氯化鈉生長、6%氯化鈉生長，10%氯化鈉不生長，不產生硫化氫。送省級疾控中心的4株陽性菌株通過PCR擴增進行霍亂弧菌毒力基因的檢測，結果霍亂弧菌毒力基因ctxA、zot.ace均為陽性，說明其屬同一型別。4株Ο139群霍亂弧菌檢測結果，見表1。

3 討論

霍亂弧菌可通過水、食物、生活接觸和蒼蠅等途徑傳播。本次疫情經流行病學調查和實驗室病原學檢測分析，確定為一起食用甲魚引起的霍亂弧菌Ο139群感染。依據：本次霍亂弧菌陽性甲魚標本來自患者購買的同一批發處，通過對患者，甲魚及甲魚養殖水分離出來的陽性菌株進行PCR毒力基因檢測，結果四株陽性菌株均為具有同一毒力基因的產毒株[2]。

當前隨著人們生活水平的提高，因聚餐食用海水產品引起霍亂疫情的事件不斷增加[4]，因此建立快速，準確檢測病原菌感染的檢測方法是有效控制疫情蔓延的重要手段。目前，霍亂弧菌病原菌感染診斷的金標準仍然是菌株的成功分離，通過增菌、分離培養及血清學生化鑒定等一系列步聚來完成，但靈敏度低，操作較繁瑣，耗費時間長，不適合基層醫療單位采用；而膠體金快速檢測法靈敏度高，特異性強，操作簡單，可作為最基層醫療單位的篩查，可以快速提供篩查報告，為控制疫情蔓延爭取時間，但其容易失效，穩定性稍差，容易出現假陽性[3]，且拿不到菌株。因此在發生疫情的病原學診斷時，為預防漏檢和縮短時間，筆者建議兩種方法同時采用。另外在本次試驗中，密切接觸者的肛拭子第一次增菌培養物膠體金法快速檢測霍亂弧菌Ο139群為弱陽性，可能與其含有的菌量過少有關，為慎重起見，研究對其進行兩次增菌后進行分離培養。而在甲魚養殖水的第一次增菌后用常規細菌分離未檢出陽性菌株，第二次增菌后才檢出陽性菌株，這可能與其甲魚的換水消毒導致菌量過少有關。為提高檢出率，建議今后的監測中應進行二次增菌，且每個平板至少挑取5個菌落進行玻片凝集。

為預防進食甲魚引起的霍亂發病，各級衛生部門應加強海水產品衛生管理措施[4]，同時也應加大衛生宣傳力度，特別是在經濟條件和衛生條件較差的農村，加工甲魚時一定要生熟分開，甲魚要煮熟煮透后食用。

[1] 衛生部衛生防疫司.霍亂防治手冊菌[M].5版.北京:衛生部疾病控制司,1999.

[2] 鄭向梅,呂均.兩株霍亂弧菌同源性分析[J].現代預防醫學,2010,37(23):4508.

[3] 王瓊妹,周登仁,徐海英,等.膠體金法應用于外環境標本中霍亂弧菌的檢測[J].中國熱帶醫學,2010(11):1374-1375.

[4] 曹衛中,陸春香,蔡藕菊,等.崇明縣海水產品霍亂弧菌污染狀況調查[J].中國衛生檢驗雜志,2007,17(9):1725-1726.