正交設計優化山野豌豆SRAP－PCR反應體系與引物篩選

劉穎，王顯國，張巨明＊，劉芳

（1.華南農業大學農學院，廣東 廣州510642；2.中國農業大學動物科技學院，北京100193；3.全國畜牧總站，北京100193）

山野豌豆（Vicia amoena）又叫落豆秧、高蔓草藤、宿根苕子，為豆科巢菜屬多年生草本植物［1］。它表現出耐寒、抗旱、葉量大、粗蛋白及動物必需氨基酸含量高、適應性廣、再生力強、容易繁殖、產量高、品質好等優點［2－5］。另外，山野豌豆不僅是一種優良牧草，而且還是很好的防風固沙水保植物［6］、改土肥田綠肥作物［7］和草坪及藥用植物［8］，具有推廣和應用價值。目前SRAP（sequence related amplified polymorphism）標記已在農作物和園藝作物上有了較多成功的應用，但SRAP在豆科牧草種質資源上的應用還非常少，僅在苜蓿（Medicago）［9－15］、大豆（Glycine）［16－18］、三葉草（Trifolium）［19，20］、山羊豆（Galege）［21］、小扁豆（Lens）［22，23］等屬有相關報道。本研究主要采用正交設計法對SRAP－PCR反應條件中主要因子：Mg2＋、dNTP、引物、Taq酶進行優化分析并確定了模板DNA濃度，旨在篩選出一個適用于野豌豆屬的穩定性及重復性好，多態性高的最佳反應條件。此外，本研究還對部分SRAP引物組合進行了多態性篩選，希望獲得一些多態性豐富的SRAP引物組合，為開展SRAP標記技術在山野豌豆種質鑒定、遺傳多樣性等方面的分子生物學研究提供有利依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用5份山野豌豆材料采自全國3個不同的地域，優化SRAP－PCR體系的DNA模板來自內蒙古呼倫貝爾的9號、山西五臺山的6號及北京百花山的14號DNA；篩選引物所用DNA模板來自山西沁源的11號、北京靈山的5號及內蒙古呼倫貝爾的9號DNA。

1.2 試驗設計與方法

1.2.1 PCR反應體系設計與引物組合 采用L9（34）正交試驗設計，對 Mg2＋、dNTP、引物、Taq DNA 聚合酶進行4因素3水平篩選（表1）。體系優化分別采用3份不同DNA進行，每份DNA做2次重復，取其平均值作為統計數據。體系總體積為25μL，除表中變化的因素外，每管中還加入2μL 10×PCR buffer和50ng的模板DNA，所用引物組合為Me2＋Em4。

1.2.2 SRAP－PCR擴增程序及擴增產物的檢測SRAP－PCR擴增程序為：94℃預變性4min；94℃變性1min，37℃退火45s，72℃延伸1min，5個循環；94℃變性1min，50℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環；循環結束后，72℃延伸7min，4℃保存。擴增結束后，在擴增產物中加入5μL 6×loading Buffer緩沖液混勻，取8μL上樣于2%的瓊脂糖凝膠中進行分離。

1.2.3 模板DNA濃度優化 應用上述體系最佳組合，引物組合為 Me2＋Em4，DNA模板為5號DNA。將25μL擴增體系中模板DNA用量分別設置6個梯度處理，即10，20，30，40，50和60ng，對反應體系中的模板DNA濃度進行優化。

1.2.4 多態性SRAP引物組合的篩選 根據上述試驗結果確定的SRAP－PCR最佳反應體系，選取Li和Quiros［24］及Riaz等［25］發表的引物序列，包括7條正向引物和14條反向引物兩兩組合成98個SRAP引物組合（表2），對3份山野豌豆種源材料進行多態性SRAP引物組合的篩選。

表1 SRAP－PCR［L9（34）］正交試驗設計Table 1 Orthogonal design for SRAP－PCR ［L9（34）］

表2 SRAP引物序列Table 2 Primer sequences used for SRAP analysis

2 結果與分析

2.1 SRAP－PCR正交試驗設計的擴增結果分析

山野豌豆SRAP－PCR體系優化的正交試驗結果如圖1所示。參照何正文等［26］的方法，對擴增結果進行直觀分析，依據譜帶的亮度、清晰度以及條帶數，將9個處理結果劃分為9個評分等級以便統計分析，內蒙古呼倫貝爾的DNA擴增結果得分為1，3，2，5，6，7，9，4和8。山西五臺山與北京百花山的DNA擴增結果得分分別為1，6，7，8，5，2，9，3和4及6，7，4，3，5，1，9，2和8。3份不同種源的9個處理結果的總平均得分為2.67，5.33，4.33，5.33，5.33，3.33，9.00，2.67，6.67。得分最高為組合7帶型清晰，亮度高，且雜帶少，擴增效果最好，選為山野豌豆基因組SRAP－PCR的最佳擴增反應體系。

參照張麗等［27］的方法，對各組分濃度組合的正交試驗結果進行了統計分析（表3），其中T值代表某水平下某因子參與反應所產生的擴增條帶的總和；K代表某因子在某水平參與反應所產生的擴增條帶的平均值；R為某因子的極差，即某因子在不同水平下最大平均值與最小平均值之差。R值的大小反映了該因子對試驗結果影響的大小，R值越大，影響越顯著。從R值可看出，在選定的3個水平范圍內，4個因素對結果的影響由大到小依次為：引物＞ Mg2＋＞Taq DNA聚合酶＞dNTP。K值反映了影響因素各水平對反應體系的影響情況，K值越大，反應水平越好。從K值結果來看，引物以水平3最好，Mg2＋以水平2最好，Taq DNA聚合酶水平3最好，dNTP以水平1最好。綜上，各因素最佳的水平具體為引物2.0μmol／L、Mg2＋2.0mmol／L、Taq DNA 聚合酶1.5U、dNTP 0.2mmol／L，該組合與直觀分析得出的最佳組合7一致，進一步確定組合7為最優組合。

圖1 SRAP－PCR正交試驗設計結果Fig.1 Electrophoresis of SRAP－PCR orthogonal design

2.2 模板DNA濃度的確定

應用上述最佳反應體系，對模板DNA設置了10，20，30，40，50和60ng 6個濃度梯度進行優化。擴增結果表明，在25μL反應體系中6種模板DNA用量均能擴增出譜帶，且帶型一致。但模板DNA濃度不同，譜帶的清晰度存在一定差異。模板DNA用量為10和20ng時條帶清晰度不佳，30～60ng條帶清晰度稍強且表現一致。考慮到節省模板用量，最終選定在25μL反應體系中加30ng模板DNA為宜。

表3 正交試驗結果的統計分析Table 3 Statistic result of the orthogonal design

2.3 反應體系的驗證及多態性引物組合的篩選

應用上述最佳反應體系，隨機組合了98對SRAP引物組合對3份山野豌豆種源進行了SRAP擴增（圖2）。結果表明，1）在篩選的98對引物組合中，94對引物組合擴增得到清晰穩定的譜帶，占總數的95.9%，表明該反應體系具有較好的穩定性；在有擴增產物的94對引物組合中有20對引物組合擴增出多態性條帶，占總數21.3%。2）98對引物共擴增出983條帶，其中20對具有多態性的引物組合擴增出的條帶總數為164條，占總條帶數的16.7%，具有多態性的條帶有30條，平均每對引物組合擴增出1.5條。3）不同引物組合檢測到的多態性位點數目存在差異，變異幅度為1～7。

3 討論與結論

3.1 正交試驗設計優化SRAP－PCR反應體系

PCR擴增體系主要影響因素包括 Mg2＋、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶以及模板DNA。本研究優化出的體系表明引物濃度對擴增結果影響最大，這與黃春瓊等［28］、周良彬等［29］的結果不一致，這主要是因為本研究在引物梯度設計時加入了以前文獻中不常見到的高濃度——2.0μmol／L，僅在昝逢剛等［30］對荔枝（Litchichinensis）和許永華等［31］對人參（Panaxginseng）的研究中分別出現過5 mmol／L和2.0μmol／L的高引物濃度。雖說文獻中常見引物濃度要以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，但本研究結果表明高濃度的引物濃度不但沒有引起錯配反而得到更清晰的條帶，從圖1可看到7道與9道均得到1kb處的條帶，而9道的引物濃度僅為0.2μmol／L，這說明此帶并非非特異性條帶。此后以6號與14號為DNA模板進行的重復試驗，也證實了2.0μmol／L的引物濃度并無非特異性擴增條帶，反而條帶清晰這一論斷。其次，影響較大的是Mg2＋濃度。這與王芳［18］、王俊娥［21］、艾鵬飛等［32］、仲叢來等［33］在大豆、山羊豆、小麥（Triticumaestivum）和麻瘋樹（Jatrophacurcas）上的試驗結果一致，這說明在SRAP－PCR反應體系中Mg2＋濃度的影響是很大的，在以后的優化試驗中要重點關注。再次，影響因子較小的是Taq DNA聚合酶用量和dNTP濃度，其中不同dNTP濃度的擴增效果差異很小。在正交試驗之后，本研究又對DNA模板用量進行了單因素優化。雖然DNA模板用量對擴增的影響不大［34，35］，但本研究證實用量過少會明顯影響條帶的數量與清晰度，DNA模板用量為10～20ng明顯沒有30～60ng的條帶清晰度高，所以本實驗選擇30ng的DNA模板用量，此結果與孫佩光等［36］、陳慶榆等［37］的研究結果一致。

圖2 優化的SRAP－PCR反應體系在部分引物組合中的擴增結果Fig.2 Results amplified by optimized system using some primer combinations

3.2 SRAP－PCR反應優化體系的驗證

本研究不僅通過98對引物對優化出的SRAP－PCR反應體系進行了驗證，而且在優化過程中選用了3種來自北京、山西、內蒙古不同地域的模板DNA取得了二次驗證，以此保證了優化體系的穩定性與良好的適用性。與此同時，本研究亦篩選出20對多態性良好的引物，對以后山野豌豆的分子生物學研究打下了良好的基礎。

3.3 結論

本研究利用正交試驗設計對山野豌豆SRAP－PCR反應體系進行優化，得到的最佳反應體系為：2μL 10×PCR buffer（不含 Mg2＋）、30ng的模板 DNA、引物2.0μmol／L、Mg2＋2.0mmol／L、Taq DNA 聚合酶1.5U、dNTP 0.2mmol／L，總體積為25μL。

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