周期性張應力對人牙周膜細胞生物學活性的影響*

劉加強 劉洪臣 房 兵 李 晉

人牙周膜成纖維細胞(human periodontal ligament fibroblast,hPDLF)對機械應力的適應性改建是正畸牙齒移動的生物學理論基礎。在正畸牙齒移動過程中，牙周組織發生一系列的生理或病理性改變，包括成骨細胞和破骨細胞的活躍[1-2]，各種細胞因子及炎性介質的表達增加，壓力側牙槽骨吸收，張力側牙槽骨增生等等[3-5]，最終使牙齒移動到新的位置達到矯治目的。其中牙周膜細胞活性的變化不僅是促進牙周組織改建的重要影響因素，也是影響牙周組織改建后穩定性的關鍵因素。本實驗采用體外培養的hPDLF，對細胞施加不同強度的周期性牽張力，檢測牽張力作用后hPDLF的總蛋白合成、堿性磷酸酶(ALP)活性、Ⅰ型膠原(Col-Ⅰ)和骨鈣素(OCN)的分泌，探討周期性牽張力對hPDLF活性的影響。

1.材料與方法

1.1 試劑和儀器 試劑：胎牛血清(Gibco,美國)，DMEM 培養基(Gibco,美國)，胰蛋白酶(Amresco,美國)，乙二胺四乙酸(EDTA)(Amresco,美國)，TritonX-100(Sigma,美國),BCA試劑盒(北京賽馳生物公司)，羥脯氨酸試劑盒(南京建成生物公司)，ALP活性檢測試劑盒(南京建成生物公司)。

儀器設備 3111型孵箱(ThermoForma，美國)，TGL-16G型高速臺式離心機(安亭,上海)，ELx800uv型酶聯免疫檢測儀(Bio-Tek，美國)，溫控超速離心機(Eppendorf,德國)，TDZS-WS型自動平衡高速離心機(湘儀，湖南)，FV500激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)，DMIL倒置相差顯微鏡(Leica，德國)。

1.2 hPDLF培養 經患者同意，取因正畸拔除的11-14歲患者的健康前磨牙，用含有1000U/L雙抗(青霉素、鏈霉素)的PBS緩沖液沖洗后，無菌條件下刮取牙根中部1/3的牙周膜組織并剪成碎片，Ⅰ型膠原酶37℃水浴振蕩消化1小時，輕輕吹打后離心。棄上清液，細胞沉淀用經DMEM洗滌后平鋪接種于6孔培養板中，加入1.5mL含20%胎牛血清的DMEM培養基，置于恒溫孵箱(5%CO2、95%空氣、100%濕度、37℃恒溫)中培養。72h后換液，以后隔日換液并觀察細胞生長情況，細胞長至培養板底約80%時傳代，標記為第1代。取5-8代細胞用于實驗[6]。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及其處理 取對數生長期細胞接種于6孔彈性培養板，密度為1×104個/孔，置于CO2恒溫孵箱中培養。培養24h后換液去除不貼壁細胞，然后采用美國Flexercell細胞加力裝置對細胞施加周期性牽張力，本實驗共分4組，根據預實驗及參考文獻[7-8]，我們分別采用強度為6%、12%、20%細胞表面拉伸率的周期性牽張力作用于細胞，頻率為拉伸5s，松弛5s，即6周期/min，作用時間為24s，并采用不加力組作為對照，共4組，每組6個樣本。

1.3.2 周期性牽張力對hPDLF總蛋白合成的影響 收集各組細胞，棄去孔內液體，用PBS沖洗 3次，每孔加入0.5%的TrtonX-100裂解液150μL過夜后，按蛋白濃度試劑盒說明用酶標儀檢測吸光度，根據標準曲線計算成總蛋白濃度(ug/mL)。

1.3.3 周期性牽張力對hPDLF內ALP活性的影響 細胞加力后并裂解后，按ALP試劑盒說明用酶標儀檢測吸光度，根據標準曲線計算ALP濃度(U/mgprot)。

1.3.4 周期性牽張力對hPDLF內Col-Ⅰ分泌的影響 細胞加力后，用細胞裂解液進行裂解，按羥脯氨酸試劑盒說明，用酶標儀檢測吸光度，間接反映細胞Col-Ⅰ活性，根據標準曲線計算Col-Ⅰ濃度(ug/mgprot)。

1.3.5 周期性牽張力對hPDLF內OCN分泌的影響 細胞加力后，取上清液進行檢測，200μL上清液加入200μL碘(125I)OCN放射免疫分析液和200μL的抗血清并充分混勻，4℃靜置24h，加 1000μL分離劑并混勻，室溫放置20min，4℃離心25min(3500rpm)，吸棄上清，檢測各組沉淀物中OCN水平(ng/mL)。

1.4 數據統計學處理 運用SPSS 13.0軟件對所得數據進行方差分析，P＜0.05為具有顯著性差異。

2.結果

2.1 周期性牽張力對牙周膜細胞總蛋白合成的影響 與不加力對照組相比較，6%的拉伸率對細胞總蛋白合成沒有影響(P＞0.05)，12%時開始下降(P＜0.05)，當達到20%時，對蛋白合成出現了顯著的抑制作用(P＜0.01)(表1，圖1)。

表1 各組細胞總蛋白表達情況

2.2 周期性牽張力對牙周膜細胞ALP活性的影響 6%和12%的拉伸率對hPDLF的ALP活性無顯著影響(P＞0.05)，當力值增至20%時，開始出現對ALP活性的抑制作用(P＜0.05)(表2，圖 2)。

2.3 周期性牽張力對牙周膜細胞Col-Ⅰ分泌的影響 6%表面拉伸率對hPDLF的Col-Ⅰ分泌無顯著影響(P＞0.05)，12%-20%拉伸率對hPDLF的 Col-Ⅰ分泌有抑制作用(P＜0.05)，并呈濃度依賴性(表3，圖3)。

圖1 總蛋白表達情況

表2 各組細胞ALP活性

圖2 ALP活性情況

表3 各組細胞Col-Ⅰ分泌情況

圖3 Col-Ⅰ分泌情況

2.4 周期性牽張力對牙周膜細胞OCN分泌的影響 6%和12%的拉伸率對對hPDLF的OCN分泌無顯著影響(P＞0.05)，20%的拉伸率對hPDLF內OCN分泌有抑制作用(P＜0.05)(表 4，圖 4)。

表4 各組細胞OCN分泌情況

圖4 OCN分泌情況

3.討論

牙周組織是人體改建最為活躍的組織之一，這與牙周組織擔負咀嚼功能，承載咬合應力有關，牙周膜細胞活性，特別是在應力刺激狀態下的活性高低直接關系到牙周組織的適應性改建能力以及牙周健康狀況[9-10]。本實驗中組織塊在培養7-10d后可見周圍有少量細胞爬出，15d左右可傳代，傳代后的細胞4-5d就能長滿瓶底的80%，并且細胞生長旺盛，活力較高，純度較高，適合本實驗后續研究。

hPDLF總蛋白含量的變化能夠反映出細胞功能的活躍程度。本實驗結果表明，周期性張應力可以抑制細胞總蛋白的合成，并且呈濃度依賴性。但在6%表面拉伸率組，細胞總蛋白含量無明顯變化，該牽拉強度不足以抑制細胞蛋白合成。隨著張應力強度的進一步升高，其抑制蛋白合成的作用開始顯現。周期性張應力一方面可以通過抑制細胞的增殖而使細胞總量下降，導致總蛋白分泌量下降，另一方面還可通過抑制hPDLF內多數酶的活性，又進一步抑制細胞總蛋白的合成。

ALP是hPDLF分化時分泌的酶，參與hPDLF的分化成熟，ALP活性的高低，能比較客觀地反映hPDLF分化成熟的趨勢。本實驗結果表明，隨著牽張力強度的增加，ALP的活性逐漸降低，并且呈濃度依賴性，說明細胞的分化能力逐漸減弱，細胞活性降低。但6%和12%表面拉伸率，都不足以影響ALP的活性。膠原是構成牙周膜基質的主要成分之一，在維持牙周組織的結構穩定和再生方面都起到重要作用。Col-Ⅰ占到骨有機基質90%以上，在細胞早期即開始分化，并隨著基質的成熟而逐漸增加。本研究結果表明，6%表面拉伸率對hPDLF的Col-Ⅰ分泌無顯著影響，12%-20%拉伸率可以呈強度依賴性抑制牙周膜細胞Col-Ⅰ的合成。說明較強的張應力能夠破壞牙周組織結構的穩定性，這可能也是頜創傷的細胞生物學機制之一。

OCN是成骨樣細胞成熟的特征性標志之一，成熟的hPDLF也可少量合成并分泌OCN，OCN釋放到牙周組織中促進牙槽骨及牙骨質的礦化。本實驗結果表明，6%和12%的拉伸率對對hPDLF的OCN分泌無顯著影響，20%的拉伸率對hPDLF內OCN分泌有抑制作用，說明較強的張應力也可影響到牙槽骨及牙骨質的礦化，甚至導致骨吸收。

綜上所述，周期性張應力可以使hPDLF的多項活性指標受到明顯抑制[11]，并且多數呈強度依賴性。但所有指標在6%表面拉伸率時均未受到影響，說明一定強度范圍內的張應力作用不會影響到牙周膜細胞的活性，這也是牙周組織能夠承擔一定咬合應力的生物學基礎。因此，臨床上合理掌控正畸力值的大小顯得非常重要，恰當的正畸作用力不僅能夠使牙齒移動，還能保證牙周膜細胞活性，促進牙周組織改建以及正畸療效的穩定

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