肝癌轉移復發監測：磁共振擴散加權成像與外周血分子生物學技術研究進展

劉新疆 綜述，王 濱, 審校

肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我國乃至世界范圍內常見的惡性腫瘤之一。HCC根治性切除術后5年內仍有60%～70%的患者出現轉移復發，復發性HCC的早期診斷和可能的化學干預是提高患者長期生存率的關鍵之一。HCC治療的發展需要有更精確、更靈敏的影像學方法對其療效作出評價。近年來，隨著MR設備、技術的迅速發展和各種掃描序列的完善，已不滿足常規解剖圖像的分析，開始了病變功能狀態的影像學探討。MR波譜分析(MR spectroscopy, MRS)、DWI和PWI是三種常用于肝臟的功能成像方法，其在HCC療效評價中的作用正被越來越多的學者所關注。臨床上也迫切需要一些生物學預后指標來監測HCC患者術后轉移復發的可能。較早報道的預測指標, 除了臨床和病理指標外，還有一些細胞水平的指標。近年來，多集中在蛋白分子指標方面。現將有關的研究進展綜述如下。

1 MR DWI像技術進展

1.1 MR DWI對運動檢測敏感的基本特性

DWI對活體水分子擴散進行測定，是將宏觀流動相位位移成像原理應用于顯微水平擴散成像。其在常規掃描序列中加入對稱的擴散敏感梯度脈沖，使得在施加梯度場方向上的水分子的相位離散加劇，信號降低。EPI是目前最快的成像方法，在數十毫秒內完成單幅圖像信號采集，可以凍結生理性活動的影響，故目前DWI常采用EPI序列采集。

1.1.1 擴散梯度

擴散梯度的程度由梯度脈沖的強度和持續時間即所謂的梯度因子(gradient factor)決定，用b值表示。由于DWI受到微循環及體內生理運動的影響，實際常采用表觀擴散系數(apparent diffusion coef fi cient, ADC)來代替實際擴散常數。

ADC的統計值目前并非完全一樣，這可能與樣本數、插入b值的多少和大小以及灌注影響程度有關。b值是DWI的擴散敏感度，b值的選擇對DWI及ADC值的測量至關重要。當b值較大或b值差大時，ADC值穩定性好，能較好的反映組織內水分子的擴散運動，而微循環對其影響較小；相反，小b值或小b值差在一定程度上反映了微循環的灌注，對水分子擴散反映不及前者，ADC值穩定性也較差[1]。在理論上，使用兩種不同b值即可獲得ADC值或擬合出ADC圖像，b值越多，ADC值愈精確，愈接近真實的ADC值[2]。

1.1.2 DWI及ADC值測量對肝臟良惡性病變的鑒別

通過對ADC值的計算從而精確分辨肝臟良惡性病變，一直是眾多學者關注的熱點。多數研究認為，肝囊腫ADC值最大，血管瘤次之，肝臟良性實質腫塊(肝腺瘤、局灶性結節增生)再次之，肝臟惡性腫瘤(原發性HCC、肝轉移瘤)最小，這四者的ADC值均與正常肝實質有顯著性差異。因此有學者試想提出肝臟良惡性病變的ADC值分界點，其中Kim等[3]提出以1.6×10－3mm2/s作為分界點，其敏感度為98%、特異度為80%，與Taouli等[4]提出的以1.5×10－3mm2/s分界點相近，但低于Ichikawa等[5]提出的5.5×10－3mm2/s，故目前尚未達成共識。而且，良惡性病變之間ADC值仍有交疊，尤其是部分肝實質性良性腫塊與HCC、血管瘤與壞死囊變較多的轉移瘤之間。

1.1.3 DWI對HCC療效的評價

以往對腫瘤治療后的隨訪僅限于對病變大小的測量、信號的改變及其強化特征，但事實上，在化療后的1～2個月內腫瘤的大小并無顯著的變化，碘油沉積灶的MRI信號難以辨別，治療后的強化也有部分來自反應性的肉芽增生。鑒于以上的原因，有學者提出了用DWI對腫瘤行療效評價的可能性。江新青等[6]用DWI 動態觀察帶瘤小鼠，將早、中、晚期腫瘤的ADC值進行對比，并與病理相對照，發現隨著病程的進展，腫瘤中心的DWI值逐漸升高。而且DWI能夠區分腫瘤中的壞死成分和存活成分，壞死組織的ADC值顯著高于存活成分，ADC值的改變早于T2WI上信號的改變，甚至早于組織學上的變化。該結果與Chenevert等[7]和Lyng等[8]的研究相符合，且為DWI對HCC療效評價的可靠性提供了佐證。2000年Geschwind等[9]通過對VX2兔動物模型實驗，并經過病理證實，行TACE后的HCC壞死區域其ADC值顯著高于存活腫瘤成分；推論這是因為當腫瘤細胞存活時，細胞膜完整而能夠限制水分子的擴散；相反，若細胞死亡，細胞膜破裂從而失去對水分子的限制作用，故他認為DWI可對TACE的療效作出定量及定性評估。2003年Kamel等[10]在人體實驗中得到了同樣的結論。

1.1.4 全身DWI技術在肝內占位病變的應用

在以往研究中，曾經有學者利用ADC鑒別肝內局灶性病變。如Moteki T等[11]和Ichikawa等[5]將ADC用于鑒別肝血管瘤與肝細胞癌，指出肝血管瘤ADC值高于肝細胞癌。也有學者更進一步對肝內局灶病變的ADC進行排序。即肝囊腫的ADC最高，依次為海綿狀血管瘤及肝實質性腫瘤[12-14]。徐賢等[15]最近通過對肝內各種占位病變ADC的比較，結論為：①肝內良惡性病變的比較，以1.6×10－3mm2/s為標準判斷病變性質的敏感度和特異度均＞90%，故可以以此對肝內病變的性質做出粗略的判斷，即若病變ADC＞1.6×10－3mm2/s，則其為良性病變的可能性比較大.而ADC＜1.6×10－3mm2/s時，病變為惡性的可能性較大。②肝內病變ADC排序，肝囊腫的ADC最大，基本可以認為若病變的ADC在3.0×10－3mm2/s以上，則其為囊腫的可能性比較大；其次為肝血管瘤及實質性腫瘤(包括轉移瘤及原發性HCC)，這與前人所測得的結果相吻合。基本可以通過ADC鑒別肝囊腫及其他病變。③肝血管瘤及轉移瘤、原發性HCC的ADC比較，通過對上述3種病變ADC的測量，發現肝轉移瘤的ADC波動較大，這可能與其組織起源不同有關；肝血管瘤、轉移瘤及原發性HCC的ADC之間有一定程度的交叉，尤其是后兩者之間的重疊程度較大。為了進一步鑒別上述病變，該研究進一步比較了各病變ADC病變/ADC肝臟比值。得出血管瘤、轉移瘤及原發性HCC與肝臟的比值依次遞增。這可能與原發性HCC多在肝硬化基礎上發生，而血管瘤及肝轉移瘤則多發生于正常肝實質有關。這一結果或許可以成為鑒別肝內實質性病變的一種新的方法。此外STIR-EPI良好的背景壓制效果使MIP三維重組的優勢得以最大程度地發揮。病變周圍組織信號被壓制后，病變部位得以清楚顯示，利于對腫瘤分期并判斷預后。背景信號抑制DWI技術在腹部肝臟占位病變的診斷方面有較高的臨床應用價值。

2 外周血分子生物學技術研究進展

2.1 外周血腫瘤細胞的檢測

早期檢測出外周血中的腫瘤細胞，對及早有效的綜合治療具有重要的臨床意義。血行轉移是HCC的主要轉移途徑，但血行轉移的診斷仍然存在困難，主要是沒有找到能準確反映早期微轉移的腫瘤相關因子。近年來發現磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3基因(Glypican-3 mRNA)、骨橋蛋白(OPN)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、PGE2、類表皮生長因子(EGFL)7、AFP mRNA、AFP-L3與HCC血行微轉移有密切的關系，而傳統檢測HCC的標記物AFP、AFU、GGT2、AP、AIF、ALD-A、5'-NPDV、VEGF等依然在HCC的檢測中有著重要意義。現將目前HCC外周血分子生物學檢測的主要相關因子做一概述。

2.2 Glypican-3 mRNA

2.2.1 Glypican-3 mRNA的概述

Glypican-3即磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3基因，是一種膜性硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)， Glypican-3結構特殊，影響多種生物效應分子，對組織、器官的發生、發展起關鍵的調節作用，幾乎在所有人類HCC和黑色素瘤細胞上表達，而在胎盤和胎肝以外的正常組織不表達。Glypican-3在HCC中過表達，而在成人正常組織(如肝、肺、腎、心、腦、脾、胃、小腸、大腸、睪丸、膀胱及胰腺中亦均不表達[16])、癌旁組織、肝炎、肝硬化組織中僅低表達或不表達。Zhu等[17]證實Glypican-3 mRNA在正常肝組織、肝灶性結節狀增生、肝硬化中低表達或不表達；相反在研究的30例HCC患者中有20例顯著表達，在5例中適度表達。Glypican-3在患者HCC中的表達相對于在正常肝組織中的表達增加，差異有統計學意義。Glypican-3被認為是HCC表達比較特有的基因。

2.2.2 Glypican-3 mRNA的檢測意義

柏凱等[18]通過檢測原發性HCC患者外周血Glypican-3，結果發現外周血Glypican-3 mRNA檢出率與腫瘤直徑、癌結節數目、臨床TNM分期、門靜脈癌栓、肝外轉移明顯相關(P＜0.05)。Ⅰ、Ⅱ期患者陽性率為36%，遠較Ⅲ、Ⅳ期患者陽性率(76%)低(P＜0.05)。說明原發性HCC早期即表現為全身性疾病，可以發生腫瘤細胞的血液性播散。隨著臨床分期的增加，外周血單核細胞Glypican-3 mRNA檢出率有增高的趨勢，提示動態觀察外周血中Glypican-3 mRNA表達有助于判斷HCC患者的預后。這和Nakano等[19]報道的即使直徑＜2 cm的高分化肝細胞癌，腫瘤細胞也可能侵蝕血管壁形成血行微轉移的結果基本相符。Glypican-3 mRNA在門靜脈癌栓的患者中表達高達90%，肝外轉移患者的外周血單核細胞Glypican-3 mRNA 100%陽性。表明隨著腫瘤逐漸進展，發生轉移的可能性增大。唐浩等[20]對大鼠肝細胞癌模型進行研究，認為外周血Glypican-3 mRNA的陽性率與HCC微轉移的發生有明顯的相關性，且高于AFP mRNA的陽性率，有望成為HCC微轉移新的診斷指標。Ding等[21]報道，41例AFP陰性的HCC中，有30例為Glypican-3 mRNA陽性，表達率為73%。因此Glypican-3 mRNA在HCC的早期發現、轉移及預后中有重要價值，并可望成為HCC特別是AFP陰性時HCC的一個新的基因標志。

3 OPN

3.1 OPN的概述

OPN即骨橋蛋白(osteopornin)，是一種分泌性磷酸化糖蛋白，以多種亞型存在于細胞內外，結構上它與多種基質蛋白相似，功能上它具有細胞因子的特點，參與機體多種病理過程。OPN含有特異的與細胞黏附有關的RGD(Arg-Gcy-Asp)序列，通過與其受體整合素、CD44等結合來促進細胞的趨化黏附和遷移，從而介導腫瘤細胞的侵襲轉移[22]。OPN及其相關分子與腫瘤轉移的關系密切。通過轉錄因子與OPN啟動子的應答元件(RAE序列、Tcf-4結合序列、AP-1結合序列、RE-1序列等)相互作用，調控OPN的表達。OPN通過促進腫瘤細胞黏附、激活生長因子受體、促進血管生成等多個環節參與腫瘤轉移過程[23]。

3.2 OPN的檢測意義

OPN參與了包括HCC在內的多種惡性腫瘤的增殖和轉移。Man等[24]報道，在103例人肝細胞癌病例中69例HCC組織中OPN基因表達水平高于癌旁組織，其中58例超過2倍以上，HCC和癌旁組織中OPN平均表達水平差異具有統計學意義(P＜0.001)；而在大鼠HCC模型中，隨著HCC的發生和發展OPN表達水平逐漸上升，可見OPN在HCC組織中高表達，且隨著HCC血行轉移而逐漸升高。崔伯康等[25]的研究中，HCC復發組血漿OPN濃度為(961.0±411.6) μg/L，復發組與無復發組血漿OPN濃度差異有統計學意義(P=0.039)。可見HCC患者血漿中OPN濃度可以作為預測HCC復發轉移的參考因子。陸健等[26]認為OPN在HCC組織中顯著高表達，且和早期復發血行微轉移相關，OPN可能參與了腫瘤血管生成的過程。因此檢測OPN有助于HCC的診斷和復發預測。

4 bFGF

4.1 bFGF概述

研究表明，bFGF是一種強力的促血管生成因子，在多種惡性腫瘤尤其是轉移性腫瘤患者的血和尿中bFGF顯著升高[27]。Nanus等[28]報道，在腎癌患者中bFGF表達升高患者預后不良。Dirix等[29]和Barton等[30]報道，在結、直腸癌、乳腺癌、宮頸癌和腎癌患者中，血清bFGF水平與腫瘤轉移復發顯著相關。由于HCC切除術后患者生存時間能較準確地反映HCC切除術后的轉移復發，選擇HCC大小和肝內有否播散，作為劃分高、低轉移復發傾向組的標準。

4.2 bFGF的檢測意義

血清bFGF水平升高超過200pg/L，作為根治性切除術后HCC轉移復發預測指標，有較高的靈敏度和特異度。結果提示，bFGF可能是預測HCC根治性切除術后轉移復發的較靈敏有效指標。一旦HCC侵襲轉移便釋放bFGF進入鄰近組織和血循環，促成腫瘤的血管生成，從而形成肝內、外轉移而致復發。HCC侵襲轉移高度依賴腫瘤血管生成。同時，bFGF水平升高也反映了HCC高度侵襲轉移的生物學特性。

5 PGE2

5.1 PGE2概述

PGE2是花生四烯酸(arachidonic acid, AA)的主要代謝物之一，細胞內PGE2的產生主要涉及磷脂酶A2、COX、PGE2合成酶(PGES)。PGE2通過刺激誘導腫瘤血管增生，抑制局部免疫功能，調節多種信號傳導途徑而影響細胞的增殖，促進腫瘤細胞的生長[31]。mPGES-1是合成PGE2的限速酶，mPGES-1僅為炎性刺激誘導所產生[32]，而且上游酶是COX-2。mPGES-1與COX-2協同作用催化AA異構轉化為PGE2，介導PGE2的即時合成和遲發合成，因此具有重要的生理和病理作用[33]。

5.2 PGE2的檢測意義

通過測HCC患者腫瘤組織和外周血PGE2水平、腫瘤組織中mPGES-1和HBx表達，發現腫瘤組織PGE2含量明顯高于癌旁肝組織，外周血中PGE2含量隨著腫瘤組織PGE2含量增高而增高，并且腫瘤組織和外周血的PGE2的水平變化均與HCC分化程度和術后是否復發轉移相關。這些研究結果提示可以通過檢測HCC患者外周血的PGE2水平來輔助評估HCC復發轉移的情況。研究結果還顯示HCC組織mPGES-1表達水平顯著高于癌旁肝組織，與外周血PGE2含量以及HCC組織中HBx表達均呈正相關，并且與腫瘤術后復發轉移密切相關。由于mPGES-1在炎癥細胞因子刺激下表達可明顯增高，并PGE2產量可隨著COX-2表達的增高而成倍增加[34]。另外有研究表明，將COX-2和mPGES-1共同轉染到人胚腎細胞HEK239可導致細胞轉化，接種到裸鼠可導致腫瘤形成[35]；動物實驗亦證實抑制PGE2可以抑制腫瘤轉移[36]；將mPGES-1抑制劑或特異性的干擾片段導入人結腸癌細胞株HCA-7可致細胞增殖顯著降低、PGE2產量顯著減少[35]。HBx和mPGES-1可能成為阻止HCC發生發展的新靶點。

6 EGFL 7

6.1 EGFL 7概述

類表皮生長因子7(epidermal growth factor-like domain 7, EGFL7)又稱為VE-statin、Neul、Notch4-1ik等，屬于分泌型蛋白。新近的研究發現，其涉及血管形成過程中成管這一關鍵性的步驟，在生理性和病理性血管的管腔形成、功能完善上發揮著重要作用，它的表達改變將影響血管的新生[36]。因此EGFL7已成為當今腫瘤治療研究的一大熱點。

6.2 EGFL7的檢測意義

目前已知EGFL7基因屬于一個小基因家族，編碼產物為含273AA的分泌蛋白，由內皮細胞及其原始細胞分泌產生。EGFL7因子被血管內皮細胞(EC)分泌后停留在EC附近，表明其可能跟細胞外基質相關，介導細胞間相互作用。用放射原位雜交檢查EGFL7的表達譜后發現：在血管生長和塑型活躍的腫瘤組織，EGFL7的表達呈顯著上調[37-38]這表明血清EGFL7可顯著提高AFP陰性HCC患者術后復發轉移的檢出率。HCC患者術后血清EGFL7水平的動態監測對診斷HCC術后復發轉移具有重要的價值，EGFL7有望成為監測HCC術后復發轉移新的血清學診斷標記物[39]。

7 AFP mRNA及AFP-L3

7.1 AFP mRNA及AFP-L3的概述

AFP是由Bregstrand等于1956年首次發現的血清蛋白成分，1963年Abelev等首先報道了它與肝細胞的密切關系。在正常情況下，這種蛋白主要來自胚胎的肝細胞，胎兒出生約2周后甲胎蛋白從血液中消失，因此正常人血清中AFP的含量尚不到20μg/L。當干細胞或生殖腺胚胎組織發生惡性病變時，有關基因重新被激活，使原來已喪失合成AFP能力的細胞又重新開始合成，以至血中AFP含量明顯升高，而且隨著病情惡化它在血清中的含量會急劇增加，AFP就成了診斷原發性HCC的一個特異性臨床指標。HCC的AFP陽性率為70%～90%。在生殖腺胚胎瘤、少數轉移性腫瘤如胃癌以及孕婦、肝炎、肝硬化中AFP可呈假陽性，但升高不如HCC明顯。利用RT-PCR技術檢測HCC患者外周血中AFP mRNA即甲胎蛋白信使核糖核酸的表達，AFP mRNA在健康志愿者、非HCC惡性腫瘤患者外周血中均為陰性；在肝細胞癌組外周血中AFP mRNA的檢出率明顯高于對照性乙型肝炎或肝硬化組。AFP mRNA檢出率與臨床分期、門靜脈癌栓、肝外轉移顯著相關。AFPL3是AFP三種異質體之一，通常AFP可分為三種異質體，即AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3。AFP異質體是AFP不均一的糖鏈異質性，即氨基酸序列相同而糖鏈不同的AFP。

7.2 AFP mRNA及AFP-L3的檢測意義

AFP仍是目前國內大多數醫院診斷HCC的主要指標，陳克林等[40]采用逆轉錄和巢氏多聚酶鏈式反應及Southern雜交技術以檢測HCC患者有無血行微轉移，AFP mRNA的陽性率為61.5%。舒宏等[41]采用AFP mRNA作為外周血HCC手術后血行微轉移的標記物，AFP mRNA的陽性率為56.7%。因此可以認為AFP mRNA可作為定性診斷原發性HCC的血液學指標，也可作為HCC細胞血行微轉移的標記物，并可判斷HCC臨床分期、轉移傾向、預后和復發[42]。AFP variants中尤以AFP-L3與小扁豆凝聚素的親和力高，其主要存在于HCC細胞中，Li等[43]指出AFP-L3在診斷HCC方面是一個高特異性指標，并且AFP-L3受慢性肝病等的影響小。Ando等[44]研究發現，35%早期HCC患者中可檢測出AFP-L3，并指出AFP-L3在早期HCC檢測中有重要意義。因此AFP、AFP mRNA及AFP-L3在HCC的早期診斷、分期及預后中有著重要意義。

綜上所述，DWI是無創性研究人體內部器官、組織代謝、生理變化改變的定量分析方法。根據DWI信號強度診斷全身各個部分的病變敏感性高，結合ADC定量測量具有較高的鑒別診斷價值。DWI檢查覆蓋范圍大(從頭顱至膝關節)、檢查時間短、費用低。盡管對病灶診斷的特異度欠佳。但具有較高的敏感度。非常適用于健康體檢及惡性腫瘤全身轉移的篩查。利用3D-MIP重組和黑白反轉技術能夠三維顯示原發灶和轉移灶。達到類似PET的圖像效果，有利于臨床醫師解讀，具有重要的臨床價值。然而DWI技術仍存在許多不足之處，如體線圈長度的限制和移床的限制，不能無限制地增加掃描長度。國內多家醫院所做的掃描并非嚴格的全身成像，而是從頭到膝關節的成像，所以稱大范圍DWI掃描；視野(FOV)越大，勻場效果越不好，因而國內多家醫院采用的FOV為36 cm×36 cm的6段掃描法。對于體形較寬的患者不能包括雙上肢。隨著3.0T MRI的出現，SNR得到了改善，但勻場的時間相對較長，可能會增加患者接受掃描的整體時間。再如頸部圖像質量較差、心臟大血管搏動偽影易漏檢相應部位病變，胃腸道高信號干擾鄰近器官的顯示和病灶的判斷，小的病變尤其是直徑＜1 cm者，有可能因為自由呼吸而遺漏。背景信號較高的臟器(如脾臟、雙腎等)其病灶易被掩蓋。段之間信號強度的差異會影響重組后圖像的視覺效果等。這些不足對軟、硬件的發展提出了一定的要求，是下一步DWI技術發展要克服的問題。

要解決HCC的轉移復發，重點是要有效地預測和預防。近年來，腫瘤轉移機制的研究進展提示轉移可能是腫瘤發生中的早期事件[45]。通過高通量蛋白芯片和蛋白質組學等技術獲得一些高復發HCC的分子標簽，在新的HCC轉移復發標記物的研究方面已經有較大的進展。建立HCC轉移的多分子預測模型，經大量臨床標本進一步驗證，尤其是前瞻性規模化驗證和加速臨床應用將是今后的主要的趨勢和研究重點[46]。對具有轉移復發傾向的HCC患者進行有效干預，對進一步提高HCC患者的治療效果、改善預后具有非常重要的臨床意義。

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