nHA／PCL復合材料組分配比對成骨細胞骨相關基因表達的影響研究

唐俊龍，王朝元，劉 介

（中南民族大學 生命科學學院，湖北 武漢 430074）

1 引言

骨包括有機相（非膠原蛋白和膠原）和無機相，羥基磷灰石（HA）是骨無機相的主要成分，約占干骨組織的45%。用HA來做骨植入材料不僅生物相容性高、機械性能好、化學性能穩定，還能明顯的促進骨的生長，故長期以來作為生物活性材料。但純HA因脆性大、抗疲勞性強度不高、難以降解［1］等缺點限制了臨床應用。聚已內酯（PCL）是線性的脂肪聚酯，具有良好的生物降解性和相容性［2］，但其強度低難以滿足骨植入材料的要求。因此，我們制成納米羥基磷灰石／聚已內酯（nHA／PCL）復合材料，它結合了兩種材料的優點，具有良好的生物相容性并能促進成骨細胞的增殖［3］，有望成為一種具有臨床前景的新穎骨替換材料。李家峰，萬美蓉［4］等的研究顯示人骨髓間質干細胞經nHA／PCL過納米羥基磷灰石／聚已內酯復合物誘導后其骨相關基因mRNA的表達上調。說明HA的加入可以提高惰性材料的生物活性，nHA／PCL可以預期，納米羥基磷灰石／聚已內酯復合物具有良好的體內成骨作用。

本文集中探討不同配比納米羥基磷灰石／聚已內酯（nHA∶PCL＝0∶100、nHA∶PCL1＝40∶60、nHA∶PCL2＝60∶40）對成骨細胞骨相關基因表達的影響，能從分子水平了解HA在復合材料中的作用和影響成骨細胞的分子機理，為其臨床應用提供理論依據。

2 實驗部分

2.1 試劑和儀器

nHA／PCL復合材料（華東理工大學生物材料研究所），小鼠成骨細胞株（MC3T3－E1，上海細胞生物研究所），DMEM培養基（Hyclone），新生牛血清（杭州四季清）、青霉素（BIOSHARP）、鏈霉素（BIOSHARP），反轉錄試劑盒（Fermentas），胰蛋白酶（Amresco），二甲基亞砜（Amresco），ALP試劑盒（南京建成生物科技公司），Trizol（Invitrogen），PCR 引物（武漢 博越 技術 有限 公司），反轉錄試劑盒（Fermentas）。CO2培養箱（HF90／240型，利康生物醫療科技控股集團），倒置顯微鏡（Motic AE21型，重慶光學儀器），普通PCR儀（Biometra，德國），凝膠成像分析儀 （JS－380A，上海培清科技）。

2.2 原代小鼠顱骨成骨細胞（PMO）培養

將新生昆明種小鼠頭顱剪碎，0.25%胰酶消化后，加入5mL培養基（含10%新生牛血清、100U／mL青霉素和100μg／mL鏈霉素），1500r／min離心5min沉淀細胞，棄上清，加培養基，轉入培養瓶中于37℃、5%CO2飽和度條件下培養。

2.3 nHA／PCL復合材料的制備

nHA和PCL按0∶100；40∶60；60∶40不同比例混勻，PCL在15MPa壓力下3min形成片狀。用砂紙打磨材料片表面并漂洗干凈，濕熱滅菌后備用。

2.4 不同配比nHA／PCL復合物對骨相關基因表達

將細胞以2×105個／cm2濃度接種于培養皿中的nHA／PCL片上，并以同樣濃度的細胞接種于普通玻璃培養瓶中作為空白對照。靜置2h，讓細胞貼壁。每皿加入含10%新生牛血清的DMEM培養基將材料片浸沒，置培養皿于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養，每3～4d換1次培養基，收集培養2、6、12d的細胞。Trizol法提取總RNA，用反轉錄試劑盒將RNA反轉成為cDNA，以cDNA為模板，用骨相關基因引物（表1）進行普通PCR。PCR反應條件：94℃，3min；94℃，30s，60℃，30s，68℃，90s，30個循環；68℃，5min。以 GAPDH 為內參基因，通過2%瓊脂糖凝膠電泳來確定骨相關基因的表達差異。用SensiAnsys軟件對目標基因與GAPDH灰度比來計算表達量。

表1 骨相關基因PCR擴增的引物序列

3 結果與分析

3.1 不同材料對骨相關基因表達的影響

3.1.1 不同材料對成骨細胞OP基因表達的影響

不同材料片對成骨細胞OP基因mRNA表達的影響見圖1。由圖1可見，經2、6、12d，nHA／PCL1和nHA／PCL2材料片在PMO細胞的上生長的成骨細胞的OP基因表達量高于對照和PCL材料片上的OP基因表達量或者接近，而PCL材料片上生長的細胞OP基因表達量要低于對照組（圖1a）。在 MC3T3－E1細胞的OP基因系中也有相同趨勢（圖1b）。

圖1 nHA／PCL and PCL對PMO和MC3T3－E1細胞OP表達的影響

3.1.2 不同材料對成骨細胞ON基因表達的影響

不同材料片對成骨細胞ON基因表達的影響見圖2。由圖2可見，nHA／PCL1和nHA／PCL2材料片在PMO細胞ON基因表達量均高于對照和PCL材料片上的ON基因表達量，而PCL材料片上生長的細胞ON基因表達量要低于對照組（圖2a）。在MC3T3－E1細胞的ON基因系中也有相同也出現了相似的趨勢（圖2b）。

圖2 nHA／PCL and PCL對PMO和MC3T3－E1細胞ON表達的影響

3.1.3 不同材料對成骨細胞OC基因表達的影響

不同材料片對成骨細胞OC基因表達的影響見圖3。經2、6、12d，OC基因的表達變化不大。2、6、12d，nHA／PCL1和nHA／PCL2材料片上生長的成骨細胞的OC基因表達量高于對照和PCL材料片上的成骨細胞OC基因表達量。PCL材料片上生長的細胞OC基因表達量要低于或近似于對照組。

圖3 nHA／PCL and PCL對PMO和MC3T3－E1細胞OC表達的影響

3.1.4 不同材料對成骨細胞ALP基因表達的影響

不同材料對成骨細胞ALP基因表達的影響見圖4。由圖4可見，經2、6、12d，ALP基因的表達量逐步降低。12d，nHA／PCL1和nHA／PCL2材料片上生長的細胞的ALP基因表達量比對照的ALP基因表達量要低于或近似于對照組。

圖4 nHA／PCL and PCL對PMO和MC3T3－E1細胞ALP基因表達的影響

4 結語

本文以成骨細胞樣細胞系（MC3T3－E1）和原代小鼠成骨細胞（PMO）這兩種成骨細胞作為材料研究的模式細胞，前者具有成骨細胞的基本生物學特性，包括堿性磷酸酶活性、Ⅰ－型膠原合成和基質礦化等；后者則更接近體內細胞活性，以此對比相同材料對不同成骨細胞的影響差異。

成骨細胞在骨形成過程中經歷分裂增殖、分化成熟和基質鈣化3個階段［5］。其中堿性磷酸酶（ALP）是一種膜結合蛋白，可水解有機磷酸酯為基質提供足夠的磷酸濃度使鈣鹽沉積于基質上，它在分化早期大量表達，在骨基質成熟過程中起重要作用，是成骨細胞分化的早期標志。骨鈣素（OC）是由成骨細胞合成和分泌的一種非膠原蛋白，它是構成成骨細胞胞外基質成分之一，能維持礦化速度，抑制異常羥基磷灰石的形成。骨連蛋白（ON）能促進細胞外基質蛋白之間的相互作用。骨橋蛋白（OPN）廣泛分布于多種組織和細胞，是一種非膠原骨基質糖蛋白，介導細胞與細胞、細胞與基質之間的相互作用，同時調節細胞的粘附、遷移、增殖、分化等過程。這些蛋白在成骨細胞分化成熟和基質鈣化過程中均有重要作用，其對應的基因統稱為骨相關基因。

實驗結果表明：nHA／PCL1、nHA／PCL2在一定程度上促進了OC、ON、OPN的表達，而對ALP的表達有較低的抑制作用，在MC3T3－E1和PMO細胞上表現無差別。說明nHA／PCL復合材料具有良好的細胞相容性和促成骨細胞活性，在惰性材料中加入一定比例的HA等材料，可提高材料的生物活性，與前人研究結果［5］一致。以此材料為基礎，可進一步優化設計，開發出新型的具有臨床應用前景的骨修復材料。

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