鄰苯二甲酸二乙酯對蟾蜍蝌蚪紅細胞微核的影響

張維建，石興玲，張超

(1.山東建筑大學 市政與環境工程學院，山東 濟南 250101;2.山東建筑大學外語學院，山東 濟南 250101)

0 引言

鄰苯二甲酸二乙酯是生產聚氯乙烯的原料。伴隨我國聚氯乙稀產業的發展，鄰苯二甲酸二乙酯造成的水質污染日趨嚴重。該物質已成為水環境中檢出最多的有機污染物之一[1]。有關鄰苯二甲酸酯類(PAES)物質的遺傳毒性研究，國內見有胡曉晴、陳如等的報道，國外見有M.Mariko，H.K.Mutsuko的報道[2－9]，但僅限于鄰苯二甲酸二丁酯和鄰苯二甲酸二甲酯等對魚類、藻類的毒性研究 ，對蟾蜍蝌蚪紅細胞微核的影響未見報道。本文探討了鄰苯二甲酸二乙酯對蟾蜍蝌蚪的致突變作用，以豐富毒理學資料。

1 鄰苯二甲酸酯研究概述

鄰苯二甲酸酯類物質(PAES)共有14種，包括鄰苯二甲酸二甲酯、(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二正丁酯(DBP)等，屬有機化合物，為無色油狀粘稠液體。

地表水和地下水中的鄰苯二甲酸酯主要來源于工業廢水的排放、PVC塑料的緩慢釋放和新的垃圾滲濾液[7]。鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)主要通過呼吸道、消化道和皮膚粘膜接觸侵入人體[4]。鄰苯二甲酸二乙酯已被美國環保署列入環境激素類物質[10]。

2 鄰苯二甲酸二乙酯對蟾蜍蝌蚪紅細胞微核影響的實驗研究

2.1 材料

本實驗所用鄰苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate，DEP)，為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。分子式:C12H14O4分子量:222.24。

實驗所用中華蟾蜍蝌蚪采自山東建筑大學映雪湖，平均體重0.22g。試驗前將其置2000mL燒杯，暴氣蒸餾水飼養一周，水溫18℃。每天上午投放一次磨細的餌料，按時觀察蝌蚪的生理狀態。

2.2 方法

(1)染毒實驗組采用不同濃度鄰苯二甲酸二乙酯染毒，染毒濃度:1.6μg/mL、3.2μg/mL、6.5μg/mL、13μg/mL、26μg/mL。染毒時間為 24h。對照組采用蒸餾水處理。每組10只蝌蚪;實驗前進行預實驗。

(2)制片取蝌蚪用紗布將體表水分擦干，在前肢和身體連接處斷肢，取血涂片晾干，瑞士染色，光學顯微鏡觀察。每組制備10張涂片，每片觀察2000個細胞，記錄具有微核及核異常的細胞數，觀察結果以千分率(‰)表示。實驗數據采用Matlable7.0統計軟件處理。

微核率=微核總數/觀察細胞總數×1000‰。

核異常細胞率(ONA‰)=具有核異常(除微核外)的細胞總數/觀察細胞的總數×1000‰

3 結果與討論

3.1 結果

3.1.1 不同濃度鄰苯二甲酸二乙酯對蟾蜍蝌蚪紅細胞的影響

不同濃度鄰苯二甲酸二乙酯對蟾蜍蝌蚪紅細胞微核的影響見表1。

表1 不同濃度鄰苯二甲酸二乙酯對蝌蚪紅細胞微核的影響(n=10)

表1 不同濃度鄰苯二甲酸二乙酯對蝌蚪紅細胞微核的影響(n=10)

注:* 為 P ＜0.05;＊＊為 P ＜0.01。

鄰苯二甲酸二乙酯濃度/(μg·mL－1)核異常細胞率/‰0.0(對照)微核率/‰0.2 ±0.05 0.1 ±0.041.6 0.3 ±0.15 0.2 ±0.143.2 0.4 ±0.05 0.4 ±0.046.5 1.2 ±0.04* 1.3 ±0.05*13. 1.4 ±0.11＊＊ 1.5 ±0.08＊＊26. 1.8 ±0.13＊＊ 1.9 ±0.08＊＊

3.1.2 鄰苯二甲酸二乙酯與蟾蜍蝌蚪紅細胞微核率及核異常率的相關分析

鄰苯二甲酸二乙酯與微核率相關分析顯示，r=0.9187，P ＜0.01，鄰苯二甲酸二乙酯濃度與蝌蚪紅細胞微核率高度相關。DEP濃度與蟾蜍蝌蚪紅細胞核異常率的相關系數 r=0.9043，P ＜0.01，鄰苯二甲酸的濃度與蟾蜍蝌蚪紅細胞核異常率高度相關。

分別以蟾蜍蝌蚪紅細胞微核率、核異常率為因變量(y)，以鄰苯二甲酸二乙酯濃度為自變量(x)進行回歸分析，得到回歸方程，見表2。

表2 微核率及核異常率與鄰苯二甲酸二乙酯染毒濃度的關系

不同濃度鄰苯二甲酸二乙酯與蟾蜍蝌蚪紅細胞微核的劑量—效應關系見圖1。

3.2 討論

3.2.1 鄰苯二甲酸二乙酯對蟾蜍蝌蚪紅細胞微核的影響

環境激素是指由于人類的生產和生活活動而釋放到環境中的、對人體內和動物體內原本營造的正常激素功能施加影響，從而影響內分泌系統正常功能的化學物質，通稱“外源性干擾內分泌的化學物質”[10]。在14種鄰苯二甲酸酯類物質中，有6種被美國環保局(EPA)列為優先控制污染物，鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)首列其中[5]。

由表1可見，鄰苯二甲酸二乙酯濃度升高至6.5 μg/mL時P＜0.05、對蝌蚪紅細胞產生顯著毒性作用，當濃度升高至 13μg/mL和 26μg/mL時，P＜0.01，差異顯著，表明此濃度鄰苯二甲酸二乙酯對蝌蚪紅細胞微核有明顯影響。實驗結果還顯示，伴隨鄰苯二甲酸二乙酯濃度升高，蟾蜍蝌蚪紅細胞出現小核，雙核及核皺縮，核質外凸、核質內凹、核碎裂現象。

圖1 鄰苯二甲酸二乙酯對蟾蜍蝌蚪血紅細胞微核的影響

由圖1可見，伴隨鄰苯二甲酸二乙酯濃度的升高，蟾蜍蝌蚪紅細胞微核細胞率，核異常細胞率不斷升高。鄰苯二甲酸二乙酯的濃度與微核率之間存在明顯的劑量—效應關系。

3.2.2 建立回歸方程的意義

本實驗分別以鄰苯二甲酸二乙酯濃度為自變量，以受試蟾蜍蝌蚪紅細胞微核率為因變量，推導出回歸方程。其意義是可根據水體中兩棲類蝌蚪紅細胞微核率數據，推測水體鄰苯二甲酸二乙酯類物質的濃度，為開展鄰苯二甲酸二乙酯水污染生物監測提供重要依據。

3.2.3 兩棲類的使用

兩棲類動物生活周期復雜，其幼體及成體均生活在水中。因皮膚濕潤，滲透性強，易吸收水體中外源性激素，污染物能在其體內富集和放大，使細胞、組織及生理功能發生顯著改變，影響其生長發育，因此在水體有害物質及水質的監測中被廣泛用作指示生物。美國內分泌干擾物篩選與檢測顧問委員會還建議將兩棲類作為一種模型動物用于評價內分泌干擾物的繁殖和發育毒性。微核試驗是檢查環境污染物對細胞染色體損傷效應的一種簡便快速有效的致突變性篩選方法。蝌蚪細胞分裂旺盛，研究表明用蝌蚪紅細胞檢測水體的環境污染物致突變時，其靈敏度要高于魚類微核試驗和細菌學試驗(Ames試驗)[4]。

3.2.4 鄰苯二甲酸二乙酯毒作用機理的探討

鄰苯二甲酸二乙酯分子結構與雌激素分子結構類似，可與雌激素競爭受體，影響雌激素功能，或影響細胞信號轉導途徑，使胚胎體內雌激素水平改變，導致胚胎性分化過程異常。有實驗證明在生物體內，鄰苯二甲酸二乙酯主要代謝為鄰苯二甲酸單酯。鄰苯二甲酸單酯側鏈越長，干擾作用越明顯[4]。

4 結論

鄰苯二甲酸二乙酯可引起蟾蜍蝌蚪紅細胞微核率升高。在其濃度升高至13μg/mL、26μg/mL時，紅細胞微核率明顯升高，與對照組相比差異顯著P＜0.01。同時還出現小核，雙核及核皺縮，核質外凸、核質內凹、核碎裂現象。鄰苯二甲酸二乙酯的濃度與微核率之間程高度相關，存在劑量—效應關系。鄰苯二甲酸二乙酯對蟾蜍蝌蚪有明顯的至突變作用，可導致蟾蜍蝌蚪紅細胞染色體的損傷。

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