卵黃高磷蛋白的純化及其對RAW264.7生長形態的影響

呂瑜峰，王亮，張佳慧，帖航，孫佩佩，吳子健

（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

卵黃高磷蛋白（phosvitin，PVS）是蛋黃中主要的磷蛋白，約占蛋黃蛋白質的 7%[1]，有 α－PVS（37、42 、45 Ku）和 β－PVS（45 Ku）兩種，其中 β－PVS 含量較 α－PVS多[2]。PVS具有獨特的物化特性，其分子中磷的含量約10%，是已知蛋白質中磷酸化程度最高的，主要原因在于其分子中約50%的氨基酸殘基是絲氨酸殘基，且90%絲氨酸殘基被磷酸化[3]。正是由于其高度磷酸化性質，使其具有很強的乳化性、抗氧化性、殺菌性以及金屬離子螯合力（蛋黃中所含的約95%的鐵離子與其結合）[4]。

目前PVS的分離純化大致可分為兩步，先是從蛋黃中分離出PVS粗品，然后采用層析技術進一步純化。然而，現有的方法常使用非食品級的有機溶劑來實現PVS與脂質的分離，會改變PVS結構，且不適合在食品工業上的應用[1－7]。Castellani等采用 Mg2+來沉淀 PVS，雖然未用有機溶劑，但提取過程過于繁瑣且耗時[8]。近來，Ko等[9]利用乙醇和鈉鹽建立了一種可以大規模提取PVS的方法，其回收率可達到97%，但所得產品純度不高。本文旨在采用陰離子交換層析提高PVS產品的純度并進一步研究其對RAW264.7細胞生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

雞蛋：市售；1－氨基－2萘酚－4－磺酸：沃凱；Coomassie R250：sigma；SDS－PAGE標準品：Fermentas；Q SepharoseTMFastFlow強陰離子交換樹脂：GEHealthcare；小鼠巨噬細胞RAW264.7:中科院上海細胞庫；胎牛血清:GBICO；DMEM培養基:Hyclone；其它試劑為國產分析純。

1.2 主要儀器與設備

UDK－159全自動凱氏定氮儀：意大利VELP公司；WFZ800－D3B紫外可見光分光光度計：北京瑞利；CXG－1電腦恒溫層析柜：上海滬西；PowerPacTMUniversal電泳儀電源：美國BIO－RAD；3－18K離心機：德國sigma；NIKON eclipse TS100—F倒置成像顯微鏡：日本；Heraeus HERAcell 240i二氧化碳培養箱：美國。

1.3 方法

1.3.1 PVS的分離

PVS制備采用Ko的方法[9]，略改進，具體如下：鮮蛋黃100 g加2倍體積水于4℃下攪拌30 min，然后離心30 min（4 000 g、4℃）；所得沉淀加入4倍體積85%的乙醇后均質2 min（3 000 r/min），再離心10 min（4 000 g、4℃），重復此脫脂過程3次；所得脫脂沉淀用9倍體積10%的NaCl溶液浸提，并調pH至4.0，于 4 ℃下攪拌 30 min后離心30 min（4 000 g、4℃），上清再經透析、凍干即得PVS粗品（PVi）。

1.3.2 PVS的純化

Q Sepharose FF（QSFF）離子交換層析（φ1.0 cm×10 cm，填充高度8 cm）純化PVS。平衡緩沖液為NaAc/HAc（20 mmol/L、pH 5.0、0.3 mol/L NaCl），樣品溶于平衡緩沖液中，上樣體積3 mL（10 mg/mL），采用0.4 mol/L～0.6 mol/L NaCl的濃度梯度進行分步洗脫，流速1 mL/min。

1.3.3 氮、磷含量的測定

凱氏定氮法測定氮含量和蛋白質含量；磷含量測定采用鉬藍法[10－11]。

1.3.4 SDS－PAGE電泳[9]

1.3.5 PVS回收率和純度測定

按Ko的方法測定PVS的回收率[9]，純度采用N/P摩爾比來衡量，其值越小表明純度越高[12]。

1.3.6 PVS對RAW246.7細胞的影響

RAW264.7按ATCC方法培養[13]。取對數期細胞接種于96孔培養板，加入終濃度為10、100、800 μg/mL的PVS，對照組為卵清白蛋白（OVA）或牛血清白蛋白（BSA）。培養24 h，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態（200×）。

2 結果與分析

2.1 純化PVS的結果

QSFF離子交換層析分離純化PVi，其中用0.3、0.5、0.6 mol/L NaCl溶液洗脫時分別得到3個組分（即A、B和C組分），層析圖譜為圖1，而0.4 mol/L NaCl洗脫時，流出液無紫外吸收變化（數據未顯示）。A組分為穿透峰，其蛋白質N/P摩爾比8.2（表1），經電泳檢測（圖2）該組分含分子量較高的HDL和分子量較低的蛋白，且低分子量蛋白組分中含有α1－PVS；圖1還顯示B組分為主要的蛋白組分；組分C相對含量很少；合并組分B和C并經電泳檢測（圖2）表明其含有β－PVS、α1－PVS 和 α2－PVS 3 種 PVS，幾乎沒有雜蛋白，即得到純化的 PVS（PVp）。

表1 PVS蛋白質檢測結果比較Table1 ComparingmeasurementresultsofobtainedPVStoKo′s

檢測得到的PVS的蛋白質含量及其N/P比以及本工藝的蛋白回收率，并與Ko等的方法得到的結果（PVSKo）進行比較。比較結果由表1可知，PVi產品回收率與PVSKo相近，但蛋白質含量卻遠低于PVSKo。PVi其N/P摩爾比為4.40，約為sigma標準品N/P（2.49）的1.8倍；但經純化后，PVp的N/P摩爾比為2.78，回收率57.60%，蛋白質含量也大幅提高（85.66%）。再同其他國內外學者的分離提取該蛋白的結果相比較：張小偉[14]等采用PEG來提取PVS后經QSFF純化，回收率僅為47%；而Castellani采用DEAE離子交換柱僅回收了42.5%的PVS，盡管純度很高（98%）；Bo Lei等將蛋黃做簡單處理后直接利用離子交換層析提取PVS，其產物的N/P摩爾比為2.44，但回收率僅為35.4%[15]。因此本工藝兼顧了PVS的純度和回收率（表1）。

2.2 PVS對RAW246.7細胞的影響

單核/巨噬細胞遍布于機體并在第一時間識別外源性物質，即能發揮先天免疫作用，也是連接先天免疫防御和獲得性免疫應答的重要樞紐[16]。RAW264.7是源于小鼠的巨噬細胞系，在無抗原刺激的靜息狀態下呈體積較小的類圓形；但當受到外源刺激時，其體積會變大，伸出大量偽足，伴有炎癥反應，見圖3。

圖3表明，隨著BSA和OVA濃度的增加，RAW264.7細胞的形態發生劇烈變化，幾乎所有的細胞被活化；但是，PVS組即便是在800 μg/mL的高濃度下，絕大多數細胞的形態仍處于靜息狀態。形學觀察表明，PVS可維持RAW264.7細胞處于靜息狀態，不會引起細胞向炎癥巨噬細胞形態的轉變。

3 結論

1）QSFF陰離子交換層析純化PVS的條件：平衡緩沖液為 NaAc/HAc（20 mmol/L、pH 5.0 、0.3 mol/L NaCl）、0.3 mol/L～0.6 mol/L NaCl不連續分步洗脫；終產品（PVp）N/P摩爾比為 2.78，回收率 57.6%，蛋白質含量85.66%。

2）在考察劑量范圍內，PVS未引起RAW264.7細胞的細胞培養形態向炎癥巨噬細胞形態的轉變。

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