響應面法優化桃花多糖提取工藝

耿明江，席榮英，喻傳華，李歡歡，耿海局，陳振中

（1.新鄉醫學院化學教研室，河南新鄉 453003；2.新鄉醫學院分析測試實驗室，河南新鄉 453003；3.新鄉第一中學，河南新鄉 453000；4.新鄉醫學院藥學院08級藥劑專業，河南新鄉 453003）

多糖是廣泛存在于動物、植物和微生物中的一類天然高分子化合物。近年來的研究表明許多多糖具有抗腫瘤[1-3]、抗衰老[3-4]、抗炎性[5]、降血糖[3，6-8]、降血脂[3，8]、增加免疫力[3，9-10]等多種生理功能。桃花是薔薇科落葉喬木桃（Prunus persica）的花朵，古籍記載桃花“味苦，平，無毒”[11]，具有“破石淋，利大小便”[11]等作用。

響應面法是利用多元二次回歸方程來擬合各因素與響應值之間的函數關系，進而分析回歸方程得出最優工藝參數的一種統計方法。Box-Behnken設計因具有因素水平少、試驗水平少等優點而成為響應面法中常用的設計方案，已廣泛用于各類條件優化試驗中。本文在單因素試驗的基礎上，利用響應面法優化桃花多糖（polysaccharide from peach blossoms，PPB）的最優提取工藝參數，以期為桃花多糖提取及其深入研究提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料

桃花，2011年4月采集于衛輝市唐莊鎮，經手工除雜、室內陰晾三天后粉碎，再置于2.5 kPa條件下恒溫（40℃）干燥72 h，密封避光貯藏備用。D-葡萄糖標準品，中國藥品生物制品檢定所；乙醇、石油醚、三氯乙酸等所用試劑均為國產分析純，使用前未做進一步純化處理。實驗用水均為去離子水。

1.2 主要儀器

UV2550紫外可見分光光度計：島津（日本）；R-206旋轉蒸發儀：上海申生科技有限公司；SBH-11循環水式真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；DZF-1恒溫真空干燥箱：上海躍進醫療器械廠；FA2104電子分析天平：上海躍平儀器有限公司；FD-1A-80真空冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司；TSH-4000離心機：天津醫療器械廠；HH-S.Z恒溫水浴鍋：鄭州長城科工貿有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖的提取

脫脂桃花粉末→熱水提取→流水冷卻→離心→上清液→4℃醇沉過夜→離心→沉淀復溶→脫蛋白→離心→上清液濃縮→冷凍干燥→灰白色粗多糖粉末。

1.3.2 多糖提取率的計算

本文在單因素試驗還是響應面試驗中原料質量均為（4.000±0.001）g。

1.3.3 單因素試驗

影響多糖得率的因素比較多，本試驗主要從提取溫度、提取時間、料液比等幾方面進行單因素試驗[2]。提取溫度選擇 50、60、70、80、90、100 ℃ 6 個水平，提取時間選取 1、2、3、4、5 h 5 個水平，料液比選取 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）5 個水平分別進行試驗。

1.3.4 響應面分析的實驗方案和因素水平

根據預試驗結果，在溫度、時間和料液比3個單因素試驗的基礎上根據Box-Behnken中心組合試驗原理，以多糖提取率為響應值采用三因素三水平的響應分析法進行試驗設計。試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面法設計因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface design

2 結果與分析

2.1 PPB紫外光譜測定

PPB紫外光譜測定見圖1。

從圖1可知，脫蛋白前PPB在278 nm波長處有比較明顯的吸收峰（a線），經三氯乙酸處理后的PPB在該波長下的吸收峰消失（b線）。由此說明經三氯乙酸處理后PPB中已經不含蛋白質。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 提取溫度對多糖提取率的影響

提取溫度對多糖提取率的影響見圖2。

由圖 2（a）可知，在50℃～100℃的溫度范圍內，隨著溫度的升高，PPB得率在相應增大，但考慮到溫度較高時水分揮發比較劇烈不易操作，因此選取80℃作為合適的提取溫度。

2.2.2 提取時間對多糖提取率的影響

由圖2（b）可知，當提取時間控制在1 h～5 h的范圍內時，隨著提取時間的延長，PPB得率在相應增大，只是當提取時間超過3 h后，PPB得率增加的趨勢變得較為平緩，因此選擇3 h作為合適的提取時間。

2.2.3 料液比對多糖提取率的影響

由圖2（c）可知，料液比介于1∶10和1∶20之間時，PPB得率會隨著溶劑體積的增加而相應增大，并且在1∶20（g/mL）時達到最大，這可能是因為在該料液比條件下PPB的溶出達到了一個最大值，此后隨著溶劑體積的增加PPB得率會相應減小，可能與隨著溶劑體積的增加在后處理過程中PPB損失較多有關。

2.3 響應面法試驗結果

2.3.1 響應面分析方案及試驗結果

響應面試驗測定結果見表2，其中實驗序號1～12為析因實驗，13～17為5個中心實驗，用來估計實驗誤差。運用Design Expert 7.1.6軟件對表2數據進行多元回歸分析。回歸分析與方差分析結果見表3。

表2 響應面設計方案與試驗結果Table 2 Response surface design and test results

概率P值越小則相應變量的顯著性越高。從表3回歸模型方差分析可以看出，模型是顯著的（P=0.003 7），該模型R2=0.923 9，說明該模型與實驗擬合較好，可用該模型對PPB提取得率進行分析和預測，對實踐具有指導意義。由F檢驗可以得到各因子的貢獻率為：A＞B＞C，即在所選取的各因素水平范圍內，對實驗結果的影響排序為：提取溫度＞提取時間＞料液比。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.3.2 因素間的交互影響

固定任何一個因素在其編碼值為0的水平，分析另外兩個因素交互對PPB得率的影響，結果如圖3所示。

圖3直觀地反映了各因素交互作用對PPB得率的影響，比較a、b、c三組圖可以得知，提取溫度因素曲線較陡峭，對PPB得率的影響最為顯著，其次是提取時間，最后是料液比。這與前面方差分析結果一致。等高線的中心點不在相應坐標范圍之內，說明PPB最佳提取條件不在各因素相應編碼－1～1的范圍之內。

2.3.3 方程求解及最佳條件

對表2進行回歸擬合后，得回歸方程為：

對回歸方程取一階偏導等于0，整理得方程組：

解方程組得：A=1.37；B=1.73；C=0.17，即最佳提取條件為 93.7 ℃，時間 4.73 h，料液比為 1∶20.85（g/mL）。考慮到實際操作的方便性，將最佳提取條件修正為：提取溫度 94 ℃、提取時間 4.7 h、料液比為 1∶21（g/mL）。

為了驗證響應面法的可行性，采用上述最優提取條件進行PPB得率驗證試驗，5次平行試驗得到實際得率為11.08%，與理論預測值11.3%誤差約為1.95%，表明該優化條件參數可靠，具有實用價值。驗證試驗結果見表4。

表4 驗證性試驗結果Table 4 Results of verifiable experiment

3 結論

通過單因素試驗設計，在此基礎上采用Design－Expert 7.1.6軟件Box－Benhnken試驗原理設計三因素三水平響應面分析法試驗，確定PPB最佳提取工藝為：提取溫度 94 ℃、提取時間 4.7 h、料液比為 1∶21（g/mL），多糖得率為11.3%。

：

[1]Liu C H,Lin Q X,Gao Y,et al.Characterization and antitumor activity of a polysaccharide fromStrongylocentrotus nuduseggs[J].Carbohydrate polymers,2007,67(3):313－318

[2]Jiang C X,Wang M C,Liu J,et al.Extraction,preliminary characterization,antioxidant and anticancer activities in vitro of polysaccharides fromCyclina sinensis[J].Carbohydrate polymers,2011,84(3):851－857

[3]楊圣,董俊杰,姜振玲,等.枸杞多糖對D－半乳糖致亞急性衰老模型小鼠的基因表達譜的影響[J].復旦學報:自然科學版,2008,47(5):639－646

[4]黃靜,荀冬雪,常興.褐菇多糖對衰老小鼠模型的抗衰老作用[J].食品工業科技,2010,31(12):326－327

[5]Wu Y,Cui S W,Tang J,et al.Preparation,partial characterization and bioactivity of water－soluble polysaccharides from boat－fruited sterculia seeds[J].Carbohydrate polymers,2007,70(4):437－443

[6]陳建國,步文磊,來偉旗,等.桑葉多糖降血糖作用及其機制研究[J].中草藥,2011,42(3):515－520

[7]楊衛,王承明.水提花生粕多糖降血糖活性的研究[J].食品工業科技,2010,31(12):330－332

[8]劉華鋼,梁秋云,蒙華琳,等.仙人掌果多糖提取物降血糖作用的實驗研究[J].中藥材,2010,30(2):240－242

[9]Chen R Z,Liu Z Q,Zhao J M,et al.Antioxidant and immunobiological activity of water－soluble polysaccharide fractions purified fromA－canthopanax senticosu[J].Food chemistry,2011,127(2):434－440

[10]Na Y S,Kim W J,Kim S M,et al.Purification,characterization and immunostimulating activity of water－soluble polysaccharide isolated fromCapsosiphon fulvescens[J].International Immunopharmacology,2010,10(3):364－370

[11](明)李時珍,撰.王育杰,整理.本草綱目(中)[M].北京:人民衛生出版社,2005:1424－1425