天然水溶性甲殼素溶液的性質

劉廷國，李斌

（1.華中農業大學食品科技學院，湖北武漢 430070；2.池州學院材料與化學工程系，安徽池州 247100）

殼聚糖（chitosan）是甲殼素（chitin）的部分N－脫乙酰產物。甲殼素在自然界中的生物合成量僅次于纖維素，估計每年自然界生物合成量將近1011t[1]。是迄今發現的唯一帶正電荷的天然堿性多糖，具有多種特殊生物活性，安全無毒，對環境無公害。廣泛應用于農業、工業、畜牧業、環境保護、日用化工、化學分析以及食品、醫藥衛生、生物工程等領域[2－3]。

由于分子內、分子間存在強氫鍵相互作用，甲殼素和殼聚糖均不溶于普通溶劑，限制了其廣泛應用[4－5]。通過均相脫乙酰化或均相乙酰化控制脫乙酰度在50%左右制備的半脫乙酰甲殼素能溶于水中[6－7]，但對其性質研究不夠深入，目前僅限于實驗室少量制備，尚不能大規模用于生產。利用凍融循環處理制備高濃度甲殼素均相溶液，通過溫和條件下的均相脫乙酰反應，制備天然水溶性甲殼素，研究其溶液性質，為天然水溶性甲殼素的制備積累基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

甲殼素（食品級，DDA=21.11%，Mη=1.20×106，過80目篩）：購自浙江金殼生物化學有限公司。除特別說明外，實驗用水均為雙蒸水，所用化學試劑均為分析純。

冰柜（BC/BD－190S，控溫范圍：4℃～－37℃，上下波動0.5℃）：青島海爾特種電冰柜有限公司；冷凍離心機（BC－010_TY2265）：美國 Beckman公司；紫外光譜儀（UV－1700）：日本Shimadzu公司；圓二色譜儀（J810）：日本Jasco公司。

1.2 水溶性甲殼素的制備

參照文獻[8]方法制備天然水溶性甲殼素（Water SolubleChitin，WSC），脫乙酰度（DDA）=（51.68±0.12）%；利用非均相脫乙酰法制備半脫乙酰甲殼素（Half Deacetylated Chitin，HDC），DDA=（49.51±0.16）%。

1.3 WSC的紫外光譜研究

WSC分別溶于0.01 mol/L乙酸（HAc）、HCl和去離子水中，分別配成1.0 mg/mL溶液，室溫平衡12 h，使用1 cm石英比色皿上機測定樣品溶液在190 nm～400 nm的紫外吸收光譜，考察溶劑對紫外光譜的影響。分辨率1 nm，掃描速率very slow，重復掃描3次。按相同方法配置樣品溶液分別考察放置時間和樣品脫乙酰度對紫外光譜的影響。

1.4 圓二色譜（Circular Dichroism，CD）

WSC分別溶于去離子水和0.01 mol/L HAc中，HDC溶于0.01 mol/L HAc中，配成1.0 mg/mL溶液，以溶劑為參比，使用0.1 mm 400 μL石英比色池測定樣品溶液在190 nm～300 nm的圓二色譜。儀器先通N2（3L/min～5L/min）預熱5min，測試中繼續通N2（10L/min～15 L/min），溫度 18℃，分辨率 0.1 nm，掃描速度200 nm/min，累加 10次。

2 結果與分析

2.1 紫外光譜

一般多糖分子結構中不存在生色團，更沒有共軛基團，很少用紫外光譜研究其結構。甲殼素卻是1種特殊的多糖，每個糖殘基的C2位置上有1個乙酰氨基，是生色團，具有紫外吸收。殼聚糖的乙酰基雖然被脫除，但殘存的少量乙酰基仍然會在紫外區產生吸收。研究者根據殼聚糖的這種特性，建立了紫外光譜法測定殼聚糖脫乙酰度的方法。直接用UV法測定殼聚糖脫乙酰度簡便、快捷，可以測定脫乙酰度60%以上的殼聚糖。劉長霞等人在此基礎上發展了一階導數紫外光譜法、多波長回歸紫外光譜法等測定殼聚糖脫乙酰度的方法，比直接測定重現性好、準確度高、干擾少[9－10]。

圖1給出了WSC在3種溶劑中的紫外光譜，在250 nm～800 nm范圍內無任何吸收。在208 nm～270 nm溶劑對紫外光譜幾乎無影響，在190 nm～208 nm對其影響較大，HAc與H2O的吸收極其相似，僅僅在吸光度大小上有差異，而HCl對其影響更為明顯，峰值不變、峰型變窄，這可能與溶劑極性不同有關。在208 nm～212 nm，吸光度值與波長呈線性關系，在水溶液中的擬合方程為：A=－0.328 6λ+71.119（R2=0.996 6）。劉長霞等人報道，不同濃度的N－乙酰基－D－葡萄糖胺溶液在波長200、201、202、203 nm處的吸光度值對波長作圖得到線性關系良好的1組直線，其斜率與對應溶液的濃度成正比，可以根據斜率確定殼聚糖的脫乙酰度[9]。也就是說，如果樣品脫乙酰度確定，則斜率應該與樣品濃度呈線性關系。

溫度在20℃～30℃時，殼聚糖水溶液放置不同時間的吸光度值與波長的關系基本不變（見表1）。實驗選擇在室溫條件下放置12 h后測定。

表1 時間對WSC溶液吸光度的影響Table 1 Effect of time on the absorption of WSC solution

水溶性樣品的DDA在50%左右，實驗選定的樣品脫乙酰度為46%～54%，在此范圍內乙酰氨基含量差別極小，因此由DDA引起的吸光度值與波長的擬合方程的斜率變化極小，可以忽略不計。

按照上述實驗方法進行操作，繪制工作曲線，準確配置1.0 mg/mL的WSC水溶液，并逐步稀釋成不同濃度的待測溶液，室溫靜置平衡12 h后上機測定，在選定波長處的吸光度值對波長作圖得到線性關系良好的1組直線，見圖2，線性相關系數大于0.990 0（n=5）。利用其斜率與對應溶液的濃度成正比繪制工作曲線。工作曲線的回歸方程為K=－0.326 5c－0.005 2，相關系數R2=0.995 1（n=10），線性范圍為0.005 mg/mL～1.000 mg/mL，如圖3所示。然而當樣品濃度低于0.025 mg/mL時，選定波長范圍內的吸光度值小于0.1，而濃度高于0.25 mg/mL時，吸光度值又大于1，所以最佳線性范圍為0.025 mg/mL～0.250 mg/mL。

2.2 圓二色譜分析

當單色左旋與右旋的圓偏振光通過某種手性樣品時，該樣品對左、右旋圓偏振光的吸收不同，這種現象叫做圓二色性。其差值△A=△AL－△AR稱為圓二色值，按波長掃描就得到了圓二色譜（CD譜）。圓二色光譜儀通過測量生物大分子的圓二色光譜從而得到生物大分子的二級結構，或者確定某些基團如羰基等在手性分子中的位置，是簡便和快捷的獲得生物大分子結構的手段之一，而且在某些情況下是其它光譜所無法替代的。

甲殼素分子中含有乙酰基團，其中的羰基是發色團，雖然其本身是對稱的，但處在不對稱的環境中也會產生Cotton效應，通常在近紫外區會發生n→π*躍遷，產生1個弱吸收帶，屬R帶吸收。

圖4是WSC和HDC在0.01 mol/L乙酸溶液中的圓二色譜圖，兩者均在190 nm～240 nm間形成1負Cotton效應（長波方向為負峰，短波方向為正峰），兩者峰形、峰位置不變，但WSC的正、負峰強度均小于HDC的。這個Cotton效應是由于羰基吸收產生的，曾有研究者認為吸收峰強度與乙酰基含量有關，而與α、β異頭碳構型、分子鏈長度、離子強度和pH無關[11]。然而實驗條件下的2個樣品DDA無顯著差異，也就是說乙酰基含量無顯著差異，導致二者吸收峰強弱不同的主要原因可能是由于二者在溶液中的構象不同，WSC在HAC溶液中分子鏈更為伸展一些，而HDC可能存在更多的螺旋結構或氫鍵相互作用[12]。

圖5給出的是WSC分別在水溶液和0.01 mol/L HAc溶液中的圓二色譜，在2種溶劑中都產生了相同的負Cotton效應，與HDC相比波長沒有發生偏移，但是在水溶液中的Cotton效應卻弱于酸溶液中的。可能原因是WSC在水中氫鍵相互作用更少，更多的以伸展的高分子鏈形式存在；而其在酸溶液中則以聚電解質形式存在，聚電解質在溶液中的自組裝會形成一定螺旋結構，因而產生Cotton效應較強的現象。說明凍融循環和均相脫乙酰打破了分子間強氫鍵相互作用，使WSC的空間結構更為舒展而更易溶于水中，且較少呈現螺旋結構和無規卷曲[12]。

3 結論

利用凍融循環處理結合均相脫乙酰制備了天然水溶性甲殼素，研究了樣品在不同溶劑中的紫外吸收光譜和圓二色譜。3種溶劑中，在208 nm～212 nm范圍內樣品溶液吸光度值與波長呈線性關系，樣品脫乙酰度確定時，直線斜率與樣品濃度呈線性關系。圓二色譜顯示，在稀酸溶液中水溶性樣品比脫乙酰度相當的非水溶性樣品，分子鏈更加伸展而易溶于水中。

：

[1]董炎明,黃訓亭,趙雅靑,等.甲殼類液晶高分子研究——低分子量殼聚糖溶致液晶性及分子量對液晶臨界濃度的影響[J].高分子學報,2006(1):16－20

[2]Baxter S,Zivanovic S,Weiss J.Molecular weight and degree of acetylation of high－intensity ultrasonicated chitosan[J].Food hydrocolloids,2005,19:821－830

[3]No H K,Park N Y,Lee S H,et al.Antibacterial activity of chitosans and chitosan oligomers with different molecular weights[J].Int J Food Microbiol,2002,74:65－72

[4]康斌,常樹全,湯曉斌,等.殼聚糖輻射降解產物的水溶性研究[J].化學工程,2007,35(4):49－52

[5]劉廷國,陳艷,李斌,等.凍融循環對甲殼素凝聚態結構和脫乙酰反應的影響[J].農業機械學報,2009,40(10):140－145

[6]Sannan T,Kurita K,Iwakura Y.Studies on chitin 2:Effect of deacetylation on solubility[J].Macromol Chem,1976,177(12):3589－3593

[7]Kurita K,Kamiya M,Nishimura S.Solubilization of a rigid polysaccharide:controlled partial N－acetylation of chitosan to develop solubility[J].Carbohyd Polym,1991,16(1):83－88

[8]劉廷國,査萍萍,楊凌霄,等.凍融循環制備天然水溶性甲殼素及其特性[J].華中科技大學學報:自然科學版,2011,39(1):70－74

[9]劉長霞,陳國華,孫明昆,等.多波長線性回歸——紫外分光光度法測定殼聚糖的脫乙酰度[J].青島海洋大學學報,2003,33(1):148－154

[10]Tan S C,Khor E,Tan T K,et al.The degree of deacetylation of chitosan:advocating the first derivative UV－spectrophotometry method of determination[J].Talanta,1998,45(4):713－719

[11]Farooqahamed S K,Acharya B,Rudrapatnam N T.Low molecular weight chitosans－preparation by depolymerization with Aspergillus nigerpectinase,andcharacterization[J].CarbohydrRes,2003,338(12):1283－1290

[12]王艷麗,張靜.白術多糖的溶液構象及其變化[J].陜西師范大學學報:自然科學版,2012,40(3):98－103