不同誘變方法對透明質酸產生菌株Sz560的誘變效應

丁勇，石孝勇，張新明

（陜西科技大學生命科學與工程學院，西安陜西 710021）

透明質酸（Hyaluronic Acid，簡稱HA）是一種高分子量的線性大分子粘多糖。1934年Meyer和Palmer首先從牛眼玻璃體中分離出透明質酸[1]，它是由β-D-葡萄糖醛酸（G1cUA）和β-D-N-乙酰氨基葡萄糖（G1cNAc）所構成的雙糖單位重復交替連接而成的連鎖狀高分子物質[2]。透明質酸具有特殊的生理作用、流變學特性和極強的持水保濕能力，廣泛應用于醫療、食品、化妝品工業等領域。

透明質酸生產主要有動物組織提取法和微生物發酵法。動物組織原料來源有限，且透明質酸的含量少、組織成分復雜、提取分離困難。而微生物發酵法所需原料簡單、產量不受原料的限制、能夠生產更高的分子量的透明質酸、由于與菌體分離、提取過程簡單，因此發酵法成為透明質酸生產的發展方向。目前微生物發酵法生產透明質酸的工業菌株多來源于鏈球菌屬[3-4]，經過傳統的物理和化學誘變方法篩選高產菌株，而誘變方法選擇是否得當直接關系到突變株的性狀表達。本文利用紫外線、硫酸二乙酯、亞硝基胍處理原始菌株Sz560以期獲得無溶血性、高效生產透明質酸的突變體。

1 材料和方法

1.1 菌種

本實驗的菌種來源于陜西科技大學生命科學與工程學院保藏的馬腺疫鏈球菌獸疫亞型，實驗室保藏號Sz560。

1.2 培養基

血瓊脂平板：70 mm血平板，購自華美生物有限公司。

種子培養基（g/L）：葡萄糖 20，NaCl 5，蛋白胨 15，酵母膏 10，牛肉膏 10，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO41.5，滅菌前調整pH7.0，121℃滅菌20 min，冷卻至溫度低于50℃，無菌條件下加人1%優級小牛血清。

搖瓶發酵培養基（g/L）：葡萄糖 20，NaCl 5，蛋白胨15，酵母膏 10，牛肉膏 10，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，滅菌前調整pH7.0，121℃滅菌20 min。

1.3 儀器與設備

Eppendorf centrifuge 5810R（Eppendorf）、J2-Mc 高速冷凍離心機：美國Beckman公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術公司；pHs-ZC型pH計：上海科學儀器廠。

1.4 致死率

以致死率確定誘變劑量，將誘變后的菌懸液與未經誘變的菌懸液經適當稀釋分別涂布于種子培養基平板上，前者平板上的菌落數為A，后者平板上的菌落數為B。計算致死率：

1.5 透明質酸分析

Bitter-Muir法[5-6]

1.6 透明質酸分析

烏式黏度計法

1.7 菌種的誘變方法

1.7.1 紫外線誘變處理

15 W紫外誘變過程：紫外燈功率15 W，照射距離39 cm，照射前打開紫外燈預熱20 min，將裝有菌懸液平皿置于磁力攪拌器上，照射 20、30、40、50、60 s，稀釋104～105倍涂布于血平板上，37 ℃避光培養 18 h～32 h。

1.7.2 硫酸二乙酯誘變

取4.5 mL菌懸液加入10%的硫酸二乙酯溶液0.5 mL，混勻放入37℃水浴鍋，50 r/min振蕩水浴10、20、30、40 min；在 4 ℃，6 000 r/min 條件下離心 10 min，去上清；加入1 mL，2.5%硫代硫酸鈉溶液充分混勻，終止誘變反應，離心去上清；取1 mL生理鹽水懸浮，稀釋倍數104～105涂血平板。

1.7.3 亞硝基胍誘變

取1 mL種子培養液，4℃，6 000 r/min離心10 min，去上清；取1 mL濃度為0.1 g/L的亞硝基胍溶液懸浮，立即放入水浴鍋中，50 r/min振蕩水浴10、20、30 min；在4℃，6 000 r/min條件下離心10 min，去上清，加入1 mL，0.1 mol/L，pH6.0的磷酸鹽緩沖液，終止誘變反應，立即4℃，6 000 r/min離心10 min，去上清，重復3次；取1 mL生理鹽水懸浮，經37.5℃培養30 min；稀釋 103～104倍涂血平板。

2 結果與討論

2.1 紫外照射的誘變效應

表1為紫外照射時間對致死率的影響，Sz560對紫外照射的耐受性差，照射時間延長，致死率越高，篩選到透明質酸產量提高幅度較大的突變株的幾率增加，傳代培養發現在致死率高的條件下回復突變率相應增加，照射時間大于80 s，致死率超過99.9%。表2為篩選出透明質酸產量有一定提高的突變株菌落形態特征，主要分為三大類，A類菌落直徑小于原始菌株（菌落直徑2 mm～4 mm，菌落呈乳白色、灰白色、半透明、血平板培養菌落表面較濕潤），其它形態特征與性狀接近于原始菌株，B類菌落基本接近原始菌株，C類在普通平板培養下，菌落表面有少量褶皺，血平板培養發現透明圈直徑減少，清晰度略有下降。

表1 紫外照射時間與致死率的關系Table 1 Relationship between UV treatment time and the mortality

表2 紫外誘變突變株的菌落形態特征Table 2 Colony morphology of UV mutant

2.2 硫酸二乙酯的誘變效應

表3為硫酸二乙酯水浴處理時間對致死率的影響，前10 min致死率達到63.05%，隨水浴時間延長致死率非線性同步上升，增加幅度趨緩。表4為篩選出透明質酸產量大幅提高的突變株菌落形態特征，該類菌落直徑僅為原始菌株的30%～50%，菌落呈圓形、表面光滑、挑起有拉絲感、無溶血性透明圈，見圖1。

2.3 亞硝基胍的誘變效應

表5為亞硝基胍水浴處理時間對致死率的影響，前10 min致死率達到69.08%，隨水浴時間延長致死率非線性同步上升，增加幅度趨緩。表6為篩選出透明質酸產量大幅提高的突變株菌落形態特征，菌落直徑、形態差異性較大，菌落呈圓形、表面光滑、挑起有拉絲感、無溶血性透明圈。

表3 DES處理時間與致死率的關系Table 3 Relationship between DES treatment time and the mortality

表4 硫酸二乙酯誘變突變株的菌落形態特征Table 4 Colony morphology of DES mutant

表5 亞硝基胍處理時間與致死率的關系Table 5 Relationship between NTG treatment time and the mortality

2.4 透明質酸生產菌復篩

3種誘變方法得到的生產性狀最好的突變菌株與原始菌株對比，由表7可知，NTG誘變得到的突變株透明質酸產量和相對分子量提高幅度大，因而確定NTG為高產透明質酸生產菌的右邊手段。

表6 亞硝基胍誘變突變株的菌落形態特征Table 6 Colony morphology of NTG mutant

表7 突變株復篩結果Table 7 Result of mutant re-screening

2.5 遺傳穩定性試驗

紫外誘變、硫酸二乙酯誘變、亞硝基胍誘變得到的各一支產量表達提高的突變菌株進行了傳代試驗，結果如圖3所示。亞硝基胍誘變的突變株產量高、遺傳穩定性好，五代培養后產量下降幅度小于10%，生物量下降幅度小于15%。亞硝基胍誘變得到的突變株所做的遺傳穩定性實驗，由圖4可知，隨著傳代次數的增加，透明質酸分子量與產量下降，在第六代透明質酸的產量與分子量下降幅度大，因此生產條件下五代以后要重新活化培養。

2.5 誘變方法對比

誘變菌株均采用對數生長期，代謝旺盛，生物活性高，易變異[7]。紫外線誘變使DNA分子形成嘧啶二聚體使雙鏈結構扭曲變形，阻礙堿基間的正常配對、引起堿基轉換、顛換、移碼突變或缺失產生突變株，紫外誘變致死效果明顯，突變體類型較多，正突變率遠小于負突變率，回復突變率也很高，遺傳性狀不穩定，單一使用效果差。硫酸二乙酯和亞硝基胍屬于烷基化試劑，使堿基許多位置上增加了烷基引起DNA分子錯配從而獲得突變株，硫酸二乙酯主要引起點突變，而亞硝基胍可作用于復制叉附近，引起多重突變株出現，因此出現菌落形態特征明顯不同的突變株。

3 結論

誘變育種是工業微生物育種的重要手段，本次試驗考察了紫外誘變、硫酸二乙酯、亞硝基胍3種誘變劑對透明質酸產生菌馬腺疫鏈球菌獸疫亞型（Streptococcus zooepidemicus）Sz560進行誘變處理，通過傳代、發酵等試驗驗證誘變效果，對比得出：

1）3種誘變方法對透明質酸產生菌顯示出較大的差異，從溶血性角度看硫酸二乙酯降低溶血性效果好，經過3輪誘變篩選到無溶血性菌株，亞硝基胍經過6～10輪誘變篩選到無溶血性菌株，紫外誘變沒有篩選到無溶血性菌株；從透明質酸產量及分子量增幅角度看依次為：亞硝基胍＞硫酸二乙酯＞紫外誘變。其中，采用亞硝基胍誘變得到一支突變株，搖瓶培養的條件下透明質酸產量達到0.498 mg/mL，分子量1.12×106u。

2）對照血平板和普通平板的菌落形態，高產菌株的菌落表面濕潤、光滑，接種針挑起有明顯的拉絲狀態，菌落的黏性大，這直接可提供比對參考，作為平板分離初篩高產透明質酸突變體的依據，從而避免較為復雜、耗時的透明質酸的化學分析檢測，降低篩選的工作強度。誘變過程出現菌落直徑縮小、凸起更明顯、菌落褶皺平鋪形態的多種突變體，這種突變體與溶血性及產量沒有趨勢性關系。

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[1]Meyer K,Palmer J W.The Polysaccharide of the vitreous humor[J].BioChem,1934,10(7):629－634

[2]LaurentTC.BiochemistryofHyaluronan[J].ActaOtolaryngol（Stockh）,1987,44(2):7－12

[3]郭學平，凌沛平，王春喜，等.透明質酸的生產[J].藥物生物技術,2000,7(1):61－63

[4]Barrie F C,Lars M B,Richard M.Microbialhyaluronic acid production[J].ApplMicro Biot,2004,66(4):341－351

[5]凌沛學.透明質酸[M].北京：中國輕工業出版社,2000:41－42

[6]Bitter T,Muri H M.A modified uronic acid carbazole reaction[J].Anal Biochem,1962,4(6):330－334

[7]丁東紅，徐文靜,等.利用玉米漿發酵生產類胡蘿卜素紅酵母的誘變選育,2010,21(9):159－162