腹瀉性貝類毒素（DSP）的兩種快速檢測方法比較

胡雪蓮，俞漪，曲勤鳳，顧文佳

（上海市質量監督檢驗技術研究院，上海 200233）

貝類毒素（Shellfish toxin）是一類由浮游藻類或微生物合成，通過食物鏈傳給貝類，并在其體內富集而形成的脂溶性次生代謝生物高分子化合物[1-3]。它的形成與海洋中有毒藻類赤潮密切相關。常見的貝類毒素包括腹瀉性貝類毒素（DSP）、麻痹性貝類毒素（PSP）、神經性貝類毒素（NSP）和健忘性貝類毒素（ASP）等。其中，腹瀉性貝類毒素的存在比較普遍，海產雙殼類、棘皮類、腹足類等軟體動物中都曾有檢出該毒素的報道[4]。近年來對中國沿海部分海域貝類毒素的調查顯示[5-7]，中國沿海部分海域赤潮活動平凡，赤潮一旦產生，海產雙殼貝類易受到貝類毒素的威脅。腹瀉性貝類毒素的主要中毒癥狀包括腹瀉（92%）、惡心（80%）、嘔吐（79%）、下腹疼痛（53%）[8]。盡管目前還沒有因DSP中毒致死的報道，但由于DSP中毒癥狀與細菌性胃腸炎類似，極易混淆，且發作時間短，目前尚無有效的治療藥物，若是延誤治療，會對健康造成較大的傷害。

目前國內外對于DSP的檢測方法以經典的小鼠法為主，該方法是AOAC（美國官方化學家協會）的標準方法，同時也是目前唯一被大多數國家所普遍接受的統一方法。我國國標GB/T 18406.4-2001《農產品安全質量無公害水產品安全要求》及2011年5月17日我國衛生部剛公布的《食品安全國家標準貝類中腹瀉性貝類毒素的測定》（征求意見稿）中的檢測方法也都是小鼠法。但該方法存在著很多不足和缺陷，如：僅能指出毒性的大小，無法確定毒素的組成和含量；所測得的毒性和小鼠品系有關，可比性較差，必須進行標準毒素校準才有可能相比；毒性測試所需時間長，重復性差；需要受過專門訓練的操作人員；小鼠維持費用較高，對實驗場地要求較高等[9]。這些不足使得人們希望能有另外一些操作簡便、可比性強、易于普及、對實驗人員和檢測場地要求相對較低的檢測手段來替代小鼠法。

本文在前期研究的基礎上[10]，著重比較了兩種貝類毒素DSP的快速篩選檢測方法——酶聯免疫法和蛋白磷酸酶抑制法，旨在較短時間內對貝類樣品中是否含有DSP進行快速篩查，以滿足當前食品安全實時監控的需要。

1 材料與方法

高純度DSP單標OA標準溶液購自瑞士ALEXIS公司，質量為50 μg。將OA標準品以1 mL 100%甲醇（分析純）溶解，制成OA母液并分裝，－18℃保存待用。使用時，將母液以1 mL 100%甲醇（分析純）稀釋成OA 濃度為 2 μmol/L（約 1 610 ppb）的中間液，作為標準品稀釋液及加標添加液。

用100%甲醇（分析純）將上述母液配制成濃度分別為 80、100、160、200、240、300 μg/kg 的 OA 標準液，分別以酶聯免疫法及蛋白磷酸酶抑制法進行檢測，每個濃度的標準品重復檢測3次。以市售新鮮海產貝類為基質，將貝類洗凈后去除貝殼，取出所有組織。用濾紙吸干貝肉上的水分，充分搗碎混勻，5.0 g/管分裝至50 mL離心管并高溫滅活。向離心管中添加OA標準品添加液，使 OA 終濃度分別為 80、100、120、140、160、200、240、300 μg/kg，分別以酶聯免疫法及蛋白磷酸酶抑制法進行檢測。每個模擬樣品重復檢測5次。

蛋白磷酸酶抑制法檢測選用TOXINLINE－DSP腹瀉性貝類毒素試劑盒（上海千慕生物科技有限公司），樣品前處理及檢測步驟勻按照試劑盒使用說明書進行。使用TECAN M200型全波長多功能微孔板分析系統進行讀數，激發波長（360±15）nm，發射波長（455±20）nm。以試劑盒中標準品OA濃度的對數值為X軸，熒光讀數值為Y軸繪制標準曲線，再由標準曲線計算得出所測樣品中的OA含量。

酶聯免疫法檢測選用ABRAXIS OKADAIC ACID（DSP）ELISA試劑盒，使用TECAN M200型全波長多功能微孔板分析系統于450 nm處進行讀數。以試劑盒中標準品OA濃度為X軸，試劑盒中標準品BX與第一個標準品B0的百分比吸光度值B/B0（%）為Y軸繪制標準曲線，再由標準曲線計算得出所測樣品中的OA含量。

2 結果與討論

2.1 篩選檢出限的提出

腹瀉性貝類毒素是一類成分十分復雜的聚醚類或大環內酯類化合物，一般可分為：酸性成分OA（大田軟海綿酸）及其天然衍生物DTX 1～3；中性成分聚醚內酯（PTXs）；其它成分，如 YTX 等[1－3]。目前已經證實與腹瀉有關的組分是其中的酸性成分OA及其衍生物DTX－1和DTX－3[3]。因此，選擇OA作為腹瀉性毒素的標準溶液進行加標回收或制備模擬染毒樣品具有較強的代表性。

目前已有13個國家或組織制定了貝類中DSP的限量標準，各國對于DSP的限量標準多數基于OA及其衍生物的小鼠i.v.LD50和i.p.LD99量而制定。如FDA、日本、加拿大、澳大利亞、新西蘭、朝鮮等制定的DSP 限量為 20 μg/100 g（200 μg/kg）；EU、德國、葡萄牙、愛爾蘭、英國等制定的DSP中主要毒性成分OA限量為 16 μg/100 g（160 μg/kg）[11]。我國 GB/T 18406.4－2001《農產品安全質量無公害水產品安全要求》規定DSP的限量為 60 μg/100 g（600 μg/kg）。參考國內外對貝類中DSP的限量要求，并考慮到本文所涉及兩種方法的實際檢出限以及該兩種方法主要應用于篩選檢測的特點，將貝類產品中DSP的陽性檢出限暫定為200 μg/kg。即將篩查結果低于200 μg/kg的樣品視為DSP陰性，而檢測結果高于這一數值的樣品視為可疑陽性。

2.2 標準溶液檢測結果

配制一系列不同濃度的OA標準液，使用上述所述兩種方法進行檢測。結果如表1、表2所示。

表1 蛋白磷酸酶抑制法對OA標準溶液檢測結果Table 1 The dictation result of OA standard solution by protein phosphatase inhibition assay

由表1、表2可見，分別使用蛋白磷酸酶抑制法和酶聯免疫法對同一濃度的OA標準溶液進行三次測試，結果具有較好的重復性。檢測所得出的判定結果與標準溶液濃度一致，即：標準溶液濃度≥200 μg/kg的，檢測結果均為陽性；標準溶液濃度低于200 μg/kg的，檢測結果為陰性，未出現陰陽性顛倒錯判的情況。三次檢測平均值與實際濃度之間的誤差在±13%之間，即本方法的檢測準確率高于85%。當OA濃度在200 μg/kg附近時，判定結果可能出現假陰性或假陽性的情況。

表2 酶聯免疫法對OA標準溶液檢測結果Table 2 The dictation result of OA standard solution by ELISA assay

2.3 模擬陽性樣品檢測結果

考慮到實際檢測的對象為貝類樣品，標準溶液與實物貝類樣品可能會有一定差異。因此選用市售貽貝貝肉，經高溫滅活后添加OA標準溶液，配制成不同濃度的模擬陽性樣品，使用上述所述兩種方法進行檢測。結果如表3、表4所示。

表3 蛋白磷酸酶抑制法對模擬陽性樣品檢測結果Table 3 The dictation result of man-made poisonous samples by protein phosphatase inhibition assay

表4 酶聯免疫法對模擬陽性樣品檢測結果Table 4 The dictation result of man-made poisonous samples by ELISA assay

由表3、表4可見，分別使用蛋白磷酸酶抑制法和酶聯免疫法對同一濃度的模擬陽性樣品重復5次檢測，結果顯示了良好的重復性。兩種方法的檢測的平均加標回收率在±14%之間。檢測的陰陽性判定結果與加標情況相一致，即：加標濃度在200 μg/kg及以上的，檢測結果均為陽性；加標濃度低于200 μg/kg的，檢測結果為陰性，未出現陰陽性顛倒錯判的情況。

以3種不同市售貝類為基質，經滅活處理后，制成OA濃度為100、240 μg/kg的模擬樣品，分別交由3名檢驗人員在盲樣的情況下使用蛋白磷酸酶抑制法和酶聯免疫法分別進行檢測。結果如表5、6所示。

由表5、表6可見，兩種方法對3種盲樣樣品的檢測結果均顯示出良好的重復性與較高的回收率。在因陽性判斷方面，3名檢驗人員的檢測結果完全一致，即：對于加標濃度為100 μg/kg的樣品，判定結果均為陰性；加標濃度為240 μg/kg的樣品，判定結果均為陽性。此結果證明，對于DSP含量明顯高于或低于篩選檢出限（200 μg/kg）的樣品，無論使用蛋白磷酸酶抑制法或是酶聯免疫法檢測，判定結果都是完全正確的。

綜合表1～表6的結果顯示，使用蛋白磷酸酶抑制法和酶聯免疫法都可以對樣品中是否含有腹瀉性貝類毒素（DSP）進行定性檢測，并可對樣品中貝類毒素的大致含量進行測定。這兩種方法的判定準確率高，僅當DSP濃度在（200±20）μg/kg時，才有可能出現假陰性或假陽性，因此都不失為行之有效的快速篩選方法。使用這兩種篩選方法，以200 μg/kg為陽性篩選檢出限，可以做到將大批量的樣品快速篩查，檢測結果≤200 μg/kg的樣品，可直接判定為DSP陰性；而檢測結果＞200 μg/kg的樣品應判定為DSP可疑陽性，顯示該水產品可能受到腹瀉性貝類毒素DSP的污染。這樣，就可以在盡可能短的時間內排除絕大部分的陰性樣品，并篩選出可能受到污染的可疑陽性樣品，送交有條件的實驗室用其他方法進行進一步確認。從而在最大范圍內節省檢測時間與人力成本，提高檢測效率。

2.4 檢驗原理及優勢比較

蛋白磷酸酶抑制法檢測腹瀉性貝類毒素DSP的基本原理是：蛋白磷酸酶可以水解為一種特殊的酶作用物并產生熒光反應，而DSP毒素的主要活性成分OA、DTX是蛋白磷酸酶的有效抑制劑[12]，能不同程度地抑制磷酸酶的活性，其抑制程度與含量相關。由于該檢測原理基于DSP的生物毒性機理，測定的是DSP中的毒性活性成分總量，能較真實地反映出樣品的毒性大小，檢測所產生的假陽性率低。值得指出的是，有研究表明，有些種類的貝類中可能含有某種成分能降低DSP的水解效率，使得本檢驗方法未必適合所有的貝類樣品[13]。就檢測時間與成本而言，使用商業試劑盒，蛋白磷酸酶抑制法對于單個樣品的檢測時間低于4 h，每個樣品的檢測成本為150元左右。但檢測中所使用的磷酸酶、底物等試劑均為一次性現配現用，從某種程度上提高了該方法的檢測成本。此外，該檢測方法需要用到價格昂貴的熒光酶標儀（全波長多功能微孔板分析系統），這也限制了該方法在基層檢驗機構的開展。

酶聯免疫法檢測DSP的基礎是抗原抗體反應，微孔板包被有針對DSP抗體的捕捉抗體，加入標準品或樣品提取液及DSP酶標記物，游離DSP與DSP標記物競爭DSP抗體，同時DSP抗體與捕捉抗體連接。再經洗滌、發色、孵育顯色等步驟，最后于450 nm處測量樣品與標準品的吸光度值，通過繪制標準曲線進行定量計算。目前，只有OA有商用的配套系列試劑盒出售，所采用的抗體僅與OA反應，但不與其他毒物如DTX、PTX、YTX反應，因此專一性較強。酶聯免疫法適用于所有的貝類樣品。該方法的檢測時間為4 h～6 h，單個樣品的檢測成本低于100元，且對檢測儀器要求較低。但由于方法的局限性，在實際檢測過程中，檢驗結果易受到樣品基質的影響而產生較多的假陽性。

3 結論

綜上所述，使用蛋白磷酸酶抑制法及酶聯免疫法可以對樣品中是否含有腹瀉性貝類毒素（DSP）進行定性檢測，并可以對樣品中貝類毒素的大致含量進行測定。與傳統的小鼠法相比，這兩種方法都具有耗時較短，重復性較好的優點。本文所提出的陽性篩選檢出限（200 μg/kg）遠低于我國相關標準的規定（600 μg/kg），說明該二方法均可作為較理想的篩選方法，在盡可能短的時間內排除絕大部分的陰性樣品，并篩選出可能受到污染的可疑陽性樣品，可以用于滿足世博會等重大場合對食品安全保障的需求。此外，由于天然含腹瀉性貝類毒素DSP樣品不易獲得，缺乏由天然陽性樣品中得出的檢測數據，還需要在后期檢測過程中對本檢測方法進行完善與補充。

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