熒光分光光度計快速測定番茄醬中微生物數量

曹鵬，楊瑞麗，徐小琳，薛梅

（石河子大學化學化工學院，新疆石河子 832003）

新疆是中國重要的加工番茄產區[1-2]，番茄制品出口量約占全國的90%，為亞洲第一[3]，其產量逐年上升。

但由于檢測手段不統一，效率低，準確性不高，番茄醬出口遭遇了越來越多的技術壁壘；特別是微生物的相關檢驗已不能滿足國際市場的需求[4]。國家質量監督檢驗檢疫總局雖頒發了SN/T2376-2009《番茄醬中主要腐敗微生物的檢驗方法》，但其檢測時間較長，仍屬于事后檢測的范圍。在實際生產過程中，每有一個包裝箱番茄醬質量出現問題，對工廠造成的直接損失約有4000元人民幣[5]，因此迫切需要一種快速的、屬于事中檢測的微生物檢驗方法。目前微生物計數的常規方法有平板稀釋計數法[6]、濁度法[7]、血球板計數法[8]、菌體干重法[9]等。第一種方法較繁瑣，復雜性差，耗時長，不能及時反映菌體生長情況，不適合大批量檢測使用；后幾種方法不能有效的區分細胞的死活，無法準確的表示番茄醬中具有活性的微生物的數量，且受培養基、代謝產物的影響較大[10]，也不適合大批量的檢測。

本實驗使用熒光分光光度法檢測番茄醬中的活性微生物，簡單快速，靈敏度高，重現性好，適于工廠大規模檢測的使用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番茄醬（新疆某番茄醬廠提供，滅菌，4℃密封保存）；供試微生物（從腐敗番茄醬中篩選的嗜熱耐酸桿菌，搖瓶培養 24 h）；吖啶橙（AO）（1×10-4mol/L，4 ℃封裝保存，西安化學試劑廠）；十二烷基磺酸鈉（SDS）（5×10-2mol/L，滅菌，室溫保存，西安化學試劑廠）。

熒光分光光度計（F-2500）：日立；生物顯微鏡（XS-213）：江蘇無錫冶金科技有限公司；血細胞計數板：上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 番茄醬中微生物的分離

準確稱取番茄醬1.0 g，加入15 mL無菌水，充分混勻，移取1.5 mL混合液于1.5 mL的離心管中；另取1.5 mL菌液于另一離心管中，設置一系列轉速（600、800、1 000、1 200、1 400 r/min） 和時間（2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 min）離心觀察醬和菌的分離情況。

1.2.2 單因素和正交試驗

秋風漸起，紫云內心崩潰了，找到夏梓桑，要了他的電話，委托他轉交一封信，信中有一份離婚協議。回到住處，紫云趕緊收拾行李，重要證件都放進一個黑色LV公文包里，連夜離開上海。列車西去，夏梓桑在站臺上向她揮手。

熒光分光光度計掃描吖啶橙溶液；激發波長為538 nm、發射波長為290 nm。依預實驗結果設定初始條件為：番茄醬1.0 g加入15 mL無菌水中混勻成番茄醬液；錐形瓶中加入菌液1.0 mL、番茄醬液4.0 mL、SDS1.0 mL混勻，再加入0.3 mL～0.9 mL AO，最終加無菌水定容至8.0 mL；將其充分振蕩并染色15 min后取1.5 mL進行離心；取離心后0.5 mL上清液微孔濾膜減壓過濾；用5.0 mL無菌水清洗濾膜上的微生物于比色皿，并以525.5 nm處熒光值評價吖啶橙用量對測定效果的影響。

在上述得到最佳AO用量的基礎上，其他條件不變，分別改變番茄醬液（1.5 mL～4.5 mL）、SDS（0.4 mL～1.6 mL）和染色時間（15 min～75 min），確定最佳番茄醬液用量、SDS用量和染色時間。并通過正交試驗進一步確定最佳檢測條件。

1.2.3 活菌數測定

取1 mL菌液加入到99 mL無菌水中，充分振蕩15 min～20 min；用血細胞計數板法計數，根據菌液的稀釋倍數，計算每毫升菌液中的菌數。

1.2.4 標準曲線

分 別 取 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 的 菌液，按最佳檢測條件測定熒光值，以熒光值為縱坐標，每克番茄醬中的活菌數為橫坐標，建立回歸方程。

2 結果與分析

2.1 番茄醬與微生物的分離

由于番茄醬本身較黏稠，只有將微生物從番茄醬中分離出來，才能在分光光度計中測定。1 000 r/min離心5.0 min后，番茄醬能有效的沉淀；而菌液中的微生物基本不產生沉淀，可以達到較好的分離效果。

2.2 單因素和正交試驗結果

不同吖啶橙用量對熒光值的影響結果見圖1。

當AO含量較小時，增加AO用量可以提高熒光強度并在0.7 mL時達到峰值。隨后隨著AO濃度的增加熒光值反而下降。在溶液相中，AO存在單體與二聚體的平衡轉化，而其二聚體不產生熒光；當AO濃度較大時，平衡向二聚體方向轉化，體系熒光值就會降低。因此體系中吖啶橙濃度不宜過大，后續實驗選擇加入0.7 mL。

2.2.2 番茄醬液用量對測定效果的影響

不同番茄醬液用量對熒光值的影響結果見圖2。

當番茄醬液用量較少時，增加番茄醬液用量可以提高熒光強度并在2.5 mL時達到峰值。增加番茄醬液用量提高了體系中微生物的數量，熒光值也隨之加強。但是加入的番茄醬液過多后，體系的粘稠度快速增加，加大了離心分離微生物的難度，回收的微生物相對減少，熒光值也隨之下降。因此后續實驗選擇加入2.5 mL番茄醬液。

2.2.3 SDS用量對測定效果的影響

不同SDS用量對熒光值的影響結果見圖3。

當SDS含量較小時，增加SDS用量可以提高熒光強度并在0.6 mL時達到峰值。隨后隨著SDS濃度的增加熒光值反而下降。在無表面活性劑存在的情況下，AO以單體和二聚體的狀態共存（以單體為主），當加入的SDS較低或較高時，體系中的二聚體比例增加，此濃度接近“預膠束”的生成濃度，在此階段形成了微小分子集合體且主要以二聚體形式存在，二聚體無熒光，故熒光強度相對較低；當SDS的用量為0.6 mL時，“預膠束”大量生成，AO分子比較均勻地分配到這些集合體中，AO單體相應增加，二聚體減少，熒光強度升高[11]。后續實驗選擇加入0.6 mL SDS。

2.2.4 染色時間對測定效果的影響

不同染色時間對熒光值的影響結果見圖4。

當染色時間較小時，增加染色時間熒光值反而下降，并于染色45 min后趨于平穩。由于番茄醬中成分較多，體系中的某些物質可能影響到了染料分子與菌體的結合，因此染色時間不宜過長，后續實驗選擇染色時間15 min。

2.2.5 正交試驗結果與分析

在上述實驗得出的較佳條件的基礎上，進行正交試驗，其結果如表1、表2所示。

表1 正交試驗結果Table 1 The results of orthogonal experiment

由表1可知，熒光法快速測定活菌數的最佳組合為 A3B2C3D3，即吖啶橙用量 0.75 mL、染色 15 min、番茄醬液用量2.8 mL、十二烷基磺酸鈉用量0.7 mL，各因素對熒光強度影響主次順序為：吖啶橙﹥時間﹥番茄醬液﹥十二烷基磺酸鈉；由表2的方差分析結果進一步可以看出，吖啶橙和染色時間對測定效果影響顯著，而十二烷基磺酸鈉和番茄醬對測定效果影響不顯著。

表2 正交設計方差分析表Table 2 Orthogonal design of variance analysis

2.3 標準曲線

在上述實驗確定的最佳檢測條件（即吖啶橙0.75 mL、十二烷基磺酸鈉0.7 mL、番茄醬液2.8 mL和染色15 min）下，依次加入1.0 mL～7.0 mL的菌液染色后測定熒光值，標準曲線如圖5所示。

3 結論

熒光法快速測定番茄醬中活菌數的最佳測定條件是：吖啶橙0.75 mL、十二烷基磺酸鈉0.7 mL、番茄醬液2.8 mL和染色時間15 min。

本實驗對熒光法測定番茄醬中活菌數進行了探索，實驗結果表明，熒光值與活菌數呈良好的線性關系，可以確定番茄醬中的活菌數。

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