親水色譜法測定甜葉菊葉片中糖苷含量

史一鳴，楊虹，李燕艷，楊天奎

（豐益（上海）生物技術研發中心有限公司，上海 200137）

甜葉菊糖苷（Steviol glycosides）是一種從甜葉菊莖葉中提取的天然甜味劑，被譽為“世界第三糖源”。與蔗糖、葡萄糖、甜蜜素、阿斯巴甜等甜味劑相比，甜葉菊糖苷具有熱量小、甜度高、口感好、耐高溫、穩定性高等特點[1]。1995年9月18日，FDA批準甜葉菊糖苷可以作為“膳食補充劑”進行銷售和消費。2004年7月6日世界聯合衛生組織正式通過允許甜葉菊糖苷在世界范圍內通用的決議[2]。我國在GB 2760-2011《食品添加劑使用標準》中明確規定，甜菊糖苷作為甜味劑允許在蜜餞涼果、熟制堅果與籽類、糖果、糕點、調味品、飲料類、膨化食品生產加工中按生產需要適量使用[3]。這些都為甜葉菊糖苷的使用提供了安全證明。

甜葉菊葉片可以用來泡制茶飲，其甜味提取物甜葉菊糖苷耐熱，酸堿條件下的性質穩定，有防腐等性能，所以可以被應用于食品工業上。其他工業領域中甜葉菊糖苷也已經廣泛被應用，例如醫藥工業，它可作為矯口劑，應用在糖漿劑、散劑、片劑等制作上，還可作為降壓劑、新陳代謝促進劑、強壯劑、減肥劑等[4]。日化工業中，甜葉菊糖苷應用在牙膏、漱口液等產品中可掩蔽某些配料的不良味感[5]。

甜葉菊中含有10種甜味成分[6]，因品種及種植環境的差異，含量有所不同。通常，蛇菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷C為含量最多的三種糖苷[1]。

關于甜葉菊中糖苷含量的測定國內外有許多報道。如分光光度法[7]、薄層色譜法[8]、毛細管電泳法[9]、高效液相色譜法[10-15]等。

與其他方法相比，高效液相色譜法具有分辨率高、檢測范圍寬等優點。本文利用超聲萃取技術、親水色譜原理，建立了一種提取步驟簡單且分析性能優異，能同時測定三種主要糖苷含量的液相色譜方法。經過方法學考察，雜質干擾低，分離度良好，回收率高，是準確可信的方法。用該方法對5種甜葉菊樣品進行測定，得到了準確的樣品數據，對甜葉菊在食品和醫藥工業中的應用具有一定的借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀（配在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器）；KuDos SK250H型超聲清洗機；北京時代北利離心機；sartorius CPA225D型十萬分之一天平；METTLER TLOEDO AB204-S型萬分之一天平；BINDER FD115烘箱；IKA A11 basic粉碎機。

對照品：蛇菊苷（購自和光純藥工業株式會社，純度＞99%）、萊鮑迪苷A（購自和光純藥工業株式會社，純度＞99%）、萊鮑迪苷C（購自 ChromaDex，純度=87%）。樣品：甜葉菊1號樣品（生產日期：2010-11-28，產自河北）、甜葉菊2號樣品（生產日期：2010-11-02，產自安徽）、甜葉菊3號樣品（生產日期：2009-07-15，產自江蘇）、甜葉菊4號樣品（生產日期：2010-10-26，產自云南）、甜葉菊5號樣品（生產日期：2010-11-22，產自云南）。無水乙醇：分析純（上海凌峰化學試劑有限公司）；乙腈：色譜純（德國Merck）；雙蒸水（豐益全球研發中心分析測試實驗室自制）。

1.2 對照品溶液配制

取蛇菊苷對照品約50.0 mg，精密稱量，置25 mL容量瓶中，用70%（g/g）乙醇/水溶液溶解，超聲，稀釋至刻度，濃度為2.0 mg/mL；取萊鮑迪苷C對照品約10.0 mg，精密稱量，置 25 mL容量瓶中，用 70%（g/g）乙醇/水溶液溶解，超聲，稀釋至刻度，濃度為0.4 mg/mL；取萊鮑迪苷A對照品約62.5 mg，精密稱量，置25 mL容量瓶中，用70%（g/g）乙醇/水溶液溶解，超聲，稀釋至刻度，濃度為2.5 mg/mL。配好的對照品溶液密封后置于4℃避光環境中保存。

1.3 樣品制備

取甜葉菊葉片置于50℃避光環境下烘烤24 h至恒重，然后用粉碎機打碎，過80目篩，存放在棕色干燥器中。精密稱取干燥的甜葉菊粉500 mg，置50 mL離心管中，精密加入20 mL 70%（g/g）乙醇/水溶液，在超聲儀中超聲30 min。然后取出，6 000 r/min離心5 min，吸取上清液。殘渣中再次精密加入20 mL 70%（g/g）乙醇/水溶液，超聲30 min。取出，6 000 r/min離心5 min。合并兩次上清液于50 mL容量瓶中，用70%（g/g）乙醇/水溶液稀釋至刻度，搖勻。吸取1.5 mL樣品溶液，用0.45 μm針式微孔濾膜過濾后進樣。

1.4 色譜條件

色譜柱：ZORBAX NH2（4.6×250 mm，5 μm），流速：1.0 mL/min，柱溫：30℃，檢測波長：210 nm，進樣量：10 μL。流動相 A：水，流動相 B：乙腈，梯度洗脫，流動相梯度見表1，獲得的對照品色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫時間表（體積比）Table 1 The schedule of gradient elution

2 方法

選取甜葉菊5號樣品為考察對象，下文中所述樣品未標明即為甜葉菊5號樣品。

2.1 線性關系考察

將“1.2”項中蛇菊苷對照品溶液用70%（g/g）乙醇/水溶液稀釋成 0.032、0.40、0.80、1.2、1.6、2.0 mg/mL 濃度；將“1.2”項中萊鮑迪苷A對照品溶液用70%（g/g）乙醇/水溶液稀釋成 0.040、0.50、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL濃度；將“1.2”項中萊鮑迪苷C對照品溶液用70%（g/g）乙醇/水溶液稀釋成 0.0032、0.040、0.080、0.12、0.16、0.20 mg/mL濃度。

吸取10 μL各濃度標準溶液進樣，按“1.4”項所述液相條件測定，得到相應色譜峰的峰面積。以峰面積為縱坐標Y，溶液濃度（mg/mL）為橫坐標X進行線性回歸計算，得到蛇菊苷、萊鮑迪苷C和萊鮑迪苷A三種糖苷的回歸方程如表2所示，結果表明，三者線性良好。

表2 三種糖苷回歸方程Table 2 The regression equations of stevioside，rebaudioside C and rebaudioside A

2.2 精密度試驗

吸取樣品溶液，重復進樣5次，每次10 μL，記錄蛇菊苷、萊鮑迪苷C及萊鮑迪苷A峰面積。三者的RSD值分別為0.36%，0.87%，0.51%，結果表明，方法精密度良好。

2.3 重復性試驗

稱取樣品3份，采用上述樣品處理方法做平行測定，所得的蛇菊苷、萊鮑迪苷C及萊鮑迪苷A RSD值如表5所示，三者都小于5%，結果表明，方法重復性良好。

2.4 加標回收率試驗

精密稱取樣品9份，按高、中、低3個濃度加入適量的3種對照品溶液，每個濃度3份。三者3個濃度的加標回收率在91%～104%之間，且RSD值小于5%。結果表明，回收率良好，方法準確。

3 討論

3.1 提取方法選擇

測定甜葉菊糖苷含量常用高效液相色譜法，其具有分辨率高、定量準確等優點，國內外有諸多相關報道，差別主要集中在提取方法與分析條件兩個方面。

提取方法上，目前主要有超聲提取法、索氏抽提法[10]、水浴震蕩提取法[11-13]。索氏抽提法耗時較長，水浴加熱震蕩步驟較為繁瑣，超聲提取法具有高效、快捷、簡單等優點，本文選擇了超聲萃取來提取甜葉菊中的糖苷物質。

在提取溶劑的選擇上，文獻報道的有甲醇[10]、乙醇水溶液[11]、沸水[12-13]等。本文對甲醇、乙醇、水、丙酮、乙醇/水溶液提取效率進行單因素試驗比較，發現乙醇/水溶液效率最高。純水或者乙醇做提取劑效率欠佳，而甲醇毒性較大。不同濃度的乙醇提取效率也存在明顯差異，通過單因素實驗考察，60%和70%質量濃度對萊鮑迪苷A提取效率最高。為了進一步確定最優條件，本文以萊鮑迪苷A含量為考察指標，對超聲提取法中的液料比、乙醇濃度、提取次數三個主要因素設計正交試驗L4（23），每組做3次平行，結果取平均值，各因素和水平選取結果如表3所示。提取時間通過單因素試驗確定，選擇30 min。正交試驗結果如表4所示。

表3 超聲提取正交試驗因素水平表Table 3 Orthogonal test factors and levels of ultrasonic extraction

表4 正交試驗結果Table 4 Results of orthogonal test

從表4中可以看出，極差從大到小依次為B＞A＞C，影響提取效果因素主次順序依次為液料比＞乙醇濃度＞提取次數。提取三次和提取兩次效果相當，所以選擇提取二次。得到的最優組合為A2B1C1，即70%（g/g）乙醇為提取劑，液料比為40∶1，提取2次，每次30 min。按此最優組合條件測得的萊鮑迪苷A含量為4.29%，高于表4中所得實驗數據，說明該條件提取效率最優。

3.2 液相分析方法選擇

分析條件上，常見的色譜柱選擇有C18柱或者氨基柱。國標GB 8270—1999《食品添加劑甜菊糖甙》中[14]介紹了測定甜葉菊糖苷純度的液相方法，采用氨基柱，乙腈和水等度洗脫。利用該方法分析甜葉菊葉片糖苷提取液，如圖2所示，糖苷峰和雜質峰不能夠完全分離，干擾顯著。嘗試不同的乙腈和水等度洗脫比例，仍無法同時擺脫雜質對3種糖苷峰型的干擾，等度洗脫模式不能滿足分析需求。

本文選擇氨基柱，其硅膠鍵合氨丙基固定相能與羥基形成氫鍵作用，在乙腈/水為流動相的條件下分析極性碳水化合物，是一種親水作用色譜方法。通過對等度洗脫條件的摸索，改變流動相乙腈和水的比例，發現雜質存在疏水性。提高流動相中乙腈比例，疏水性雜質能相對較早的被洗脫，而糖苷化合物因為氫鍵作用仍保留在固定相中。然后降低乙腈比例，提高流動相極性，糖苷化合物便被洗脫出來，從而降低了雜質的干擾。

在90%乙腈等度洗脫條件下，3種糖苷化合物在40 min內沒有出峰，同時，疏水性雜質已經基本洗脫出色譜柱，然后，調整乙腈濃度到75%，3種糖苷化合物即刻快速的洗脫出色譜柱，如圖2所示，分離度良好，達到了理想的分離要求。從3種糖苷化合物結構分析，萊鮑迪苷A分子中羥基最多，與固定相氫鍵作用最強，所以保留能力最強，因此，在該色譜條件下3種化合物的出峰順序依次為蛇菊苷、萊鮑迪苷C及萊鮑迪苷A。

3.3 甜葉菊樣品測試結果

對5種甜葉菊葉片進行糖苷含量測定。按“2”項中所述方法對不同品種葉片進行處理，每個品種取3份。按上述色譜條件分析，測定峰面積，代入回歸方程，計算出含量，結果如表5所示。

表5 甜葉菊葉片中三種主要糖苷檢測結果Table 5 The content of stevioside，rebaudioside C and rebaudioside A in different brands of Stevia Rebaudiana Bertoni

4 總結

在醫藥工業上，蛇菊苷在對分離的胰島和β細胞具有直接的促胰島素分泌效應，能明顯降低血糖水平，抑制高血糖素分泌[15]，服用甜葉菊糖苷能夠明顯降低午餐后血糖的提高幅度[16]，因此富含蛇菊苷的甜葉菊具有很好的藥用開發價值。通過測定糖苷組分含量，1號、3號、5號樣品比較適合藥物開發。與其他糖苷成分相比，萊鮑迪苷A的口感更接近蔗糖，并且甜度是蔗糖的450倍[1]，所以可以在食品工業中作為蔗糖的替代品。從實驗數據看出，2號、4號樣品富含萊鮑迪苷A，更合適作為食品添加劑來使用。

本文采用超聲萃取法高效、快捷地提取出甜葉菊葉片中糖苷成分，利用親水色譜原理排除雜質干擾，并很好的分離了3種主要的甜葉菊糖苷成分，是一種性能和適用性都較好的分析方法，本方法的建立對甜葉菊品質鑒定具有重要意義。

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