酶電極法測定雞精中谷氨酸鈉含量

馮東，王丙蓮，*，李雪梅，李大海，劉仲惠

（1.山東省科學院生物研究所，山東濟南 250014；2.山東省生物傳感器重點實驗室，山東濟南 250014）

雞精，是以雞肉粉、鮮味劑、淀粉、蔗糖、食鹽等為原料，經過配制、混合、造粒、干燥等過程加工而成的一種具有雞肉鮮香風味的調味品，因其特有的風味而越來越受到廣大消費者的喜愛。目前人們多用雞精做湯料的增味劑，谷氨酸鈉（麩氨酸鈉）是味精的主要成分，也是雞精產品中的主要鮮味物質，作為雞精產品的主要原料，其含量一般標示量為35%左右[1]。由于雞精類產品中谷氨酸鈉檢測目前尚無國家標準或行業標準，而某些企業標準中也未制定谷氨酸鈉的標準測定方法，雖然相關標準中谷氨酸鈉主要測定方法有3種—高氯酸滴定法、旋光法和酸度計法[2－5]，但由于雞精成分比味精復雜得多，其中旋光性和水不溶性物質的存在，導致上述方法不適用。而高效液相色譜分析費用昂貴且操作復雜，因此建立一種切實可行的、適合于雞精中谷氨酸鈉含量的測定方法成為必要。

酶電極分析法是將酶蛋白分子采用交聯作用固定化制成固定化酶膜，再與電化學基礎電極相結合，構成酶電極生物傳感器用于特異性底物分析的一項生物技術。該方法具有專一性高、穩定性好、檢測快速而靈敏等特點[6]。酶電極研究起步于20世紀60年代，自2000年以來，生物傳感器技術在環境監測[7]、食品安全[8]、軍事[9]和醫學[10－11]等方面的應用日益廣泛，其用于食品谷氨酸、谷氨酸鈉的檢測研究較少[12]。本研究中，我們采用谷氨酸酶電極分析儀測定雞精中谷氨酸鈉的含量，并對其準確性和穩定性進行了評估，通過重現性和回收率等試驗，證明該方法測定結果準確、高效，具有實際使用意義。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

谷氨酸氧化酶膜：谷氨酸氧化酶SIGMA公司生產，利用戊二醛交聯法制成固定化酶膜圈，置于冰箱待用；緩沖溶液為0.1 mmol/L，pH=7.2的磷酸緩沖液；采用市售雞精；谷氨酸對照品；其它試劑均為分析純。

SBA－40E生物傳感分析儀由山東省科學院生物研究所自制。

1.2 測定原理

生物傳感分析儀SBA－40E利用酶促反應來定量，其樣品分析原理如下：

SBA－40E生物傳感分析儀結構示意圖如圖1所示。

樣品室側面裝有過氧化氫電極，電極表面覆蓋固定化的谷氨酸氧化酶酶膜。含有谷氨酸鈉的底物在樣品室內與固定化谷氨酸氧化酶層接觸并反應，產生的H2O2由過氧化氫電極檢測并轉變為電信號，該電流信號經放大處理顯示測定結果，并自動記錄和打印。因為產生的H2O2的量與谷氨酸質量濃度成線性比例關系，故可測定樣品中谷氨酸含量，進而換算得谷氨酸鈉含量。

酶電極及固定化酶膜結構如圖2所示。

電極系統包括兩個酶電極及其插頭，固定化谷氨酸氧化酶酶層通過酶膜片及O型密封圈固定于酶電極頂端。系統通過固定化酶層實現對谷氨酸、谷氨酸鈉的催化反應，生成的H2O2由過氧化氫電極檢測并顯示，從而實現對谷氨酸、谷氨酸鈉的測定。

1.3 方法

1.3.1 谷氨酸標準溶液

準確稱量谷氨酸，蒸餾水稀釋成質量濃度依次為0.5、1、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100 mg/100 mL 的谷氨酸標準溶液，密封放置，用于檢驗生物傳感分析儀的線性范圍和檢測靈敏度。

1.3.2 SBA－40E生物傳感分析儀環境要求

該分析儀需要0.5平方米的工作臺，工作臺平整潔凈，避免日曬。操作環境溫度要求15℃～35℃，相對濕度低于90%。

1.3.3 測定步驟

1.3.3.1 SBA－40E生物傳感分析儀定標

為保持谷氨酸酶膜活性，系統緩沖劑采用0.1 mmol/L，pH=7.2的磷酸鹽緩沖液。采用100 mg/100 mL谷氨酸溶液作為分析儀定標液。SBA－40E生物分析儀開機后，系統進行自檢，后指示燈提示進樣。用微量進樣器準確吸取25 μL定標液快速注入反應室，儀器自行運轉，并顯示測定結果。根據儀器提示用谷氨酸標準液重復定標幾次，最終SBA－40E自動定標為100，然后可進行樣品測定。

1.3.3.2 雞精樣品測定

精確稱取適量雞精樣品，蒸餾水使其充分溶解，并按一定比例稀釋，調整pH為6～8。根據分析儀“進樣”指示，準確吸取25 μL稀釋的雞精樣品，并注入反應池。反應20 s后分析儀自行顯示并打印測定結果，根據分析儀測定數值，結合雞精稀釋倍數和谷氨酸、谷氨酸鈉換算系數，即可計算雞精中谷氨酸鈉含量。

1.4 數據處理方法

采用t檢驗分析，比較液相色譜儀法與SBA－40E生物傳感分析儀測定結果之間的顯著性差異，判斷SBA－40E生物傳感分析儀能否達到液相色譜儀對谷氨酸鈉檢測的準確度。

2 結果與分析

2.1 測定的最適pH

谷氨酸氧化酶作為一種蛋白質，過酸或過堿環境均導致其活性下降，以致失活，從而嚴重影響SBA－40E分析儀測定的準確度。本試驗采用磷酸鹽緩沖體系，配制pH 1～10的緩沖液，結果表明，pH7.0左右時谷氨酸氧化酶酶活性最高。鑒于此，SBA－40E生物傳感分析儀系統選用pH7.2的磷酸緩沖液。待測雞精樣品溶液需調整pH到6～8，強酸或強堿樣品液均將導致谷氨酸氧化酶酶膜失活。

2.2 線性范圍確定

上述試驗條件下，分別測定谷氨酸系列標準溶液（0.5、1、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100 mg/100 mL），進樣體積25 μL。依據SBA－40E生物傳感分析儀顯示結果繪制標準曲線，如圖3。

圖3結果表明，在1 mg/100 mL～100 mg/100 mL范圍內，SBA－40E生物傳感分析儀顯示值與谷氨酸的質量濃度之間呈良好的線性關系。谷氨酸質量濃度為X，顯示值為Y，線性回歸方程為：y=0.999 19－0.033 2x，相關系數R為0.999 86。該質量濃度范圍內的谷氨酸可由SBA－40E直接檢測。超出該質量濃度范圍時，SBA－40E顯示值遠遠偏離回歸曲線，由此可判斷該方法對谷氨酸的檢測下限與檢測上限分別為1mg/100mL、100 mg/100 mL，相應的谷氨酸鈉的檢測下限、檢測上限分別為1.27 mg/100 mL、127 mg/100 mL。谷氨酸鈉質量濃度高于其檢測上限時需要稀釋測定。

2.3 該方法的回收率檢驗

本研究利用回收試驗進一步驗證該方法的準確性。最佳試驗條件下，取市售3種品牌雞精樣品，稀釋后每個樣品平均分成2份，其中一份加入等體積質量百分比濃度為30%的谷氨酸鈉對照溶液做回收試驗。按照“1.3.3”步驟測定各試樣谷氨酸鈉含量。由回收率計算公式：P=（加標試樣測定值－試樣測定值）/加標量×100%，結果見表1。

表1 加標回收率（n=5）Table 1 Recovery of standard addition（n=5）

由表1中的數據可知，用酶電極法測定雞精樣品回收率為99.3%～101.2%，處于98%～102%之間，表明該方法用于雞精中谷氨酸鈉含量的測定準確度較高。

2.4 酶電極法與高效液相色譜法測定雞精谷氨酸鈉含量的對比試驗

取5種雞精樣品，按相應倍數稀釋后，分別用酶電極法、高效液相色譜法（HPLC）、高氯酸滴定法進行谷氨酸鈉含量測定。每個測試重復6次，試驗結果如表2所示。

表2 雞精谷氨酸鈉含量對比測試結果（n=6）Table 2 Comparative test results for sodium glutamate in chicken essence between SBA-40E and HPLC，perchloric acid titration

表2數據顯示，測定雞精中谷氨酸鈉含量，酶電極法與高效液相色譜法、高氯酸滴定法相比較無顯著差異（P＞0.05）。綜上表明，采用酶電極法檢測雞精中谷氨酸鈉含量準確度高亦較高，而酶電極法較之液相色譜分析和高氯酸滴定具備操作簡單、成本低廉的優勢，故SBA－40E生物傳感分析儀有望代替高效液相色譜、高氯酸滴定法等，成為測定雞精中谷氨酸鈉含量的新方法、新手段。

2.5 該方法的專一性驗證

作為食品添加劑的5′鳥苷酸二鈉、5′肌苷酸鈉、維生素B2、白糊精等與谷氨酸鈉共存于雞精，本試驗驗證了酶電極法對谷氨酸鈉的檢測專一性及其抗干擾能力。配制5′鳥苷酸二鈉、5′肌苷酸鈉、維生素B2、白糊精等干擾物的質量濃度為50 mg/100mL的溶液，利用SBA－40E進行含量測定，并以50 mg/100mL的谷氨酸鈉標準液作對比，結果見表3。

表3 SBA-40E生物傳感器的專一性試驗（n=6）Table 3 Specificity test of the biosensor SBA-40E for sodium glutamate mg/100 mL

由表3可以看出，SBA－40E能夠準確測定溶液中谷氨酸鈉含量，而對其它幾種雞精中的食品添加劑均無明顯響應，說明該方法對雞精谷氨酸鈉的專一性較高，用于雞精中谷氨酸鈉含量測定時能有效排除其它常見雜質的干擾。

2.6 該方法的重現性

取某品牌雞精樣品分為6份，采用酶電極法對稀釋為100 mg/100 mL的雞精樣品谷氨酸鈉進行測定，觀察SBA－40E的重現性，結果如表4。

表4 SBA-40E的重現性試驗Table 4 Reproduicibility test of the biosensor SBA-40E %

相對標準偏差（RSD）為0.74%。該試驗結果證實該方法用于雞精谷氨酸鈉檢測具有較好的重現性。

2.7 該方法的穩定性

運用SBA－40E生物傳感分析儀對已知濃度的谷氨酸鈉溶液進行測試，每5天測定1次，每次6個平行，連續測定3個月，考察分析儀的穩定性。數據顯示，分析儀測試結果沒有明顯變化，酶膜活性穩定，這說明谷氨酸氧化酶酶膜3個月內能保持較高活性，SBA－40E生物傳感器在此期間亦具有良好的穩定性。3個月后可通過更換谷氨酸氧化酶酶膜實現酶電極分析儀的繼續使用。

3 結論

本研究利用生物傳感技術建立了SBA－40E型傳感分析儀，創建了簡潔、快速檢測雞精谷氨酸鈉含量的新方法。該方法直接測定雞精中的谷氨酸鈉，無需進行樣品前處理；檢測靈敏度高，檢出下限為1.27 mg/100 mL；加標回收率高，為99.3%～101.2%；檢測速度快，每個樣品測試僅需20 s；檢測專一性強，不受雞精中其他添加劑，5′鳥苷酸二鈉、5′肌苷酸鈉、維生素B2和白糊精等的干擾；重現性及穩定性好；結果準確可靠，相對標準偏差為0.74%；與高效液相色譜儀等相比較，其測定結果無顯著差異（P＞0.05）；線性范圍寬，適用于目前絕大部分雞精樣品中的谷氨酸鈉含量測定；且該方法操作簡單，使用成本低，可使用分析純試劑，更適于味精行業中谷氨酸鈉含量的監控。因此，本方法有望代替高效液相色譜法和高氯酸滴定法，成為當前雞精等調味料生產過程中谷氨酸、谷氨酸鈉等監控的新方法。

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