鱈魚皮膠原活性多肽的制備研究

劉春娥，劉峰，劉蘇瑤，楊燁

（中國農業大學煙臺研究院，山東煙臺 264670）

膠原蛋白廣泛存在于動物的皮、骨、軟骨、牙齒中，是結締組織極其主要的結構蛋白，起著支持結構器官、保護機體的作用。由于膠原蛋白的獨特結構，使其具有穩定的性質，難以分解，因此很難被人體吸收，食用效率低[1-2]。現代研究表明，將膠原蛋白水解為膠原多肽后，其營養及生理功能可顯著提高：蛋白質消化吸收率幾乎達100%[3]。目前，蛋白水解的方式通常采用酶解法，相對于化學法其反應條件溫和，反應時間短，產品營養價值高，易于人體消化吸收[4-6]。能用于蛋白酶解的酶類種類較多，不同的酶類酶解效果不同，水解得到的產物活性也不相同。

以鱈魚皮為試驗對象，研究4種不同蛋白酶在最適作用條件下的酶解效果，進而對4種酶解液的抗氧化效果進行對比研究。

1 材料與方法

1.1 材料

鱈魚皮由山東東方海洋科技股份有限公司提供。

1.2 儀器和試劑

UV1901紫外可見分光光度計：上海鳳凰化學儀器；pH計：上海精密儀器；中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶：上海藍季科技發展有限公司；總抗氧化力試劑盒、清除超氧陰離子自由基試劑盒：南京建成生物工程公司；其他試劑為分析純。

1.3 方法

1.3.1 酶解液制備[7]

魚皮自然解凍后，稱取一定量的魚皮放置于燒杯中，將約200 mL 0.5%的NaOH倒入燒杯中，沒過魚皮，浸泡0.5 h后，反復水洗至中性。再加入約200 mL 0.5%的H2SO4浸泡0.5 h，水洗至中性，加入一定量的蒸餾水，將魚皮剪碎。

用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl調節pH，加入一定量的酶，恒溫水解，攪拌，反應至設定時間。水解結束后，將水解液置于90℃的水浴內滅活10 min，然后自然冷卻。

1.3.2 酶解正交優化試驗設計

對4種蛋白酶分別考察不同的pH、酶解溫度、加酶量和酶解時間對酶解效果的影響，以水解度（Degree of Hydrolysis，DH）為考察指標。

1.3.3 水解度測定[8]

水解度測定采用茚三銅比色法。

1.3.4 抗氧化能力測定

采用試劑盒法。

2 結果與分析

2.1 4種酶正交試驗結果

對4種蛋白酶在單因素試驗的基礎上，選擇pH、酶解時間、酶解溫度和加酶量4個因素，設定3個水平，進行正交試驗，試驗結果如下。

2.1.1 胰蛋白酶正交試驗結果

胰蛋白酶酶解條件正交試驗結果，見表1。

表1 胰蛋白酶酶解條件正交試驗結果Table 1 The results of orthogonal test of trypsin

由R值可以看出，各因素對酶解鱈魚皮的影響由強到弱為D＞B＞A＞C，即時間＞溫度＞pH＞加酶量。根據影響因素的結果顯示采用胰蛋白酶酶解的最佳工藝：加酶量3%、溫度50℃、pH6.5、時間6h，此條件下的DH%為15.32%。

2.1.2 中性蛋白酶正交試驗結果

中性蛋白酶正交試驗結果見表2。

表2 中性蛋白酶酶解條件正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal test of neutral protease

續表2 中性蛋白酶酶解條件正交試驗結果Continue table 2 The results of orthogonal test of neutral protease

由表2結果可以看出，各因素對酶解鱈魚皮的影響由強到弱為C＞A＞D＞B，即加酶量＞pH＞時間＞溫度。根據影響因素的結果顯示采用中性蛋白酶酶解的最佳工藝：加酶量4%、溫度 45℃、pH6.5、時間4 h，此條件下的DH%為10.21%。

2.1.3 堿性蛋白酶正交試驗結果

堿性蛋白酶正交試驗結果見表3。

表3 堿性蛋白酶酶解條件正交試驗結果Table 3 The results of orthogonal test of properase

根據表3結果，各因素對酶解鱈魚皮的影響由強到弱為A＞B＞C＞D，即加pH＞溫度＞加酶量＞時間。根據影響因素的結果顯示采用堿性蛋白酶酶解的最佳工藝：加酶量4.5%、溫度50℃、pH 8.5、時間 5 h，此條件下的DH%為13.87%。

2.1.4 木瓜蛋白酶正交試驗結果

木瓜蛋白酶正交試驗結果見表4。

表4 木瓜蛋白酶酶解條件正交試驗結果Table 4 The results of orthogonal test of papain

續表4 木瓜蛋白酶酶解條件正交試驗結果Continue table 4 The results of orthogonal test of papain

由表4可以看出，各因素對酶解鱈魚皮的影響由強到弱為 D＞C＞A＞B，即時間＞加酶量＞pH＞溫度。根據影響因素的結果顯示采用木瓜蛋白酶酶解的最佳工藝：加酶量4.5%、溫度55℃、pH7、時間5 h，此條件下的DH%為17.19%。

2.2 4種酶解液多肽抗氧化效果測定

按照4種蛋白酶各自最適作用條件水解鱈魚皮，不同蛋白酶酶解得到的魚皮膠原多肽的總抗氧化力測定結果見表5，除超氧陰離子自由基的測定結果見表6。

表5 4種酶解液總抗氧化力測定結果Table 5 The results of the total antioxidized ability of four enzyme digestion solution

表6 4種酶解液對超氧陰離子自由基的清除效果Table 6 Scavenging activities of four enzyme digestion solution on O2-

從表5可以看出，堿性蛋白酶酶解液的總抗氧化能力最高，達到2.431 U/mgprot，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解液的總抗氧化能力接近。從表6可以看出，4種鱈魚皮酶解液對O2-均有一定程度的清除作用，中性蛋白酶酶解液的清除效果最好。

3 結論與討論

機體新陳代謝所產生的自由基，是代謝過程中的副產品，包括羥自由基、超氧陰離子自由基、過氧化物等，它們均可造成機體損傷[10]。因此篩選具有清除自由基和抗脂質過氧化的功能因子是目前熱門的研究課題。現代科學研究證實，天然蛋白質經水解后所產生的多肽具有免疫調節、降血壓、抗氧化等生理調節作用[11]。本實驗結果表明鱈魚皮膠原多肽粗品具有一定的抗氧化能力。不同的酶水解得到的多肽其總抗氧化能力和清除超氧陰離子自由基能力并不一致。在本實驗4種酶中，堿性蛋白酶和中性蛋白酶酶解液的抗氧化能力要明顯高于胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，而木瓜蛋白酶酶解的水解度最高。這一實驗結果提示，在多肽提取過程中，不能單純以水解度這一指標來衡量蛋白酶的優劣。

采用4種不同的蛋白酶對鱈魚皮進行酶解，制備多肽溶液。結果顯示，以水解度為指標，木瓜蛋白酶的酶解效果最好，水解度可以達到17.19%，胰蛋白酶次之，水解度可達到15.32%。4種蛋白酶酶解鱈魚皮得到的多肽溶液均具有抗氧化能力，能有效地清除超氧陰離子自由基。以總抗氧化力為指標，堿性蛋白酶的酶解液抗氧化力最強，中性蛋白酶酶解液清除超氧陰離子自由基的能力最強。

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