大豆小分子肽生物學功能效果評價

李茂輝，李碩，郭紅，閻萍

（1.沈陽醫(yī)學院預(yù)防醫(yī)學系衛(wèi)生檢驗中心，遼寧沈陽 110034；2.昆明理工大學生物技術(shù)研究中心，云南昆明 650224；3.沈陽二四二醫(yī)院，遼寧沈陽 110034）

自1902年英國科學家Buyliss和Starling在動物的胃腸內(nèi)第一次發(fā)現(xiàn)活性多肽物質(zhì)以來，到現(xiàn)在人們已發(fā)現(xiàn)和分離出100多種存在于生物體內(nèi)的多肽。特別是近30年，隨著生物醫(yī)學的發(fā)展和分離檢測水平的提高，對于多肽研究取得巨大的進展。人們發(fā)現(xiàn)，多肽物質(zhì)除了具有一般蛋白質(zhì)的營養(yǎng)作用外，對人體還具有非常重要的不可替代的調(diào)節(jié)作用，這種作用幾乎涉及到人體的所有生理活動。例如：神經(jīng)、消化、吸收、代謝、循環(huán)、生長、生殖、內(nèi)分泌等等[1]。

近年來，大豆蛋白產(chǎn)品的開發(fā)利用已受到食品工業(yè)的高度重視。大豆蛋白的乳化性及吸油性等功能特性，已被人們廣泛地接受和認識。為了進一步提高大豆產(chǎn)品的營養(yǎng)功能和加工特性，提高大豆蛋白產(chǎn)品的利用價值與附加值，大豆肽的開發(fā)研究已成為國內(nèi)外研究的熱點[2]。

大豆多肽是大豆蛋白經(jīng)水解而制成的低分子肽混合物，無論是理化特性、營養(yǎng)特性還是功能特性都優(yōu)于大豆蛋白質(zhì)。研究表明這些低分子肽具有調(diào)節(jié)血壓、降低膽固醇、促進脂肪代謝、提高機體免疫力、延緩衰老等功能，其應(yīng)用前景非常廣泛，市場潛力巨大[3]。我們采用來源廣泛廉價的粗胰酶預(yù)處理脫脂大豆餅粕后，再用中性微生物蛋白酶做酶源，研究完成了大豆小分子多肽的實驗室制備工藝和質(zhì)量檢測標準方面的工作，取得了無蛋白質(zhì)變性，無豆腥味，無殘渣，分子量小，易溶于水，在酸性條件下也不產(chǎn)生沉淀，溶液粘性小和受熱不凝固等特性，它是一種活性小分子肽（分子量300 u～700 u）。本實驗采用實驗室自己研制的大豆小分子肽，通過動物實驗?zāi)Ｐ蛠硖接懫淇蛊诤涂寡趸纳飳W功能。為更好地開發(fā)大豆小分子肽提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆餅粕（蛋白質(zhì)含量55.55%）：遼寧省昌圖縣。

粗胰酶（1.93 kat）：由沈陽醫(yī)學院預(yù)防醫(yī)學系衛(wèi)生檢驗中心自制，工藝流程：采用新鮮胰臟一加2倍水→磨成胰漿→pH5.5的氯化鈣激活劑激活胰漿→乙醇沉淀→室溫干燥→粗胰酶粉→回收乙醇

根據(jù)國家藥典中的測定方法以酪蛋白為底物（1.5%），用硼酸鹽緩沖液稀釋配成相應(yīng)濃度，采用氯化鈣激活，在40℃下酶促反應(yīng)30 min，以三氯醋酸（5%）沉淀，在257 nm處測定吸收，以確定胰蛋白酶的活力單位[4]。

中性蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶10.00 kat）：北京奧博星生物工程公司。其它生物與化學試劑均為本地化學試劑公司生物純和分析純，大豆小分子多肽液經(jīng)濃縮→噴霧干燥→大豆小分子肽粉→用去離子水配成透明溶液以備灌胃用。該工藝制成大豆小分子肽采用高效凝膠過濾色譜法（HPGFC）測定：小分子多肽峰值分子量范圍為300 u～700 u之間。

1.2 實驗動物

實驗動物昆明種小白鼠，Wister種大白鼠由本學院實驗動物中心提供。昆明種小白鼠200只，雌雄各半，體重（18±2）g，按性別、體重隨機分為1個對照組和3個試驗組。分組后飼養(yǎng)觀察3 d，剔除不合格個體后灌胃，空白對照組灌胃適量去離子水，各實驗組灌胃大豆小分子肽溶液，劑量分別為每天3、6、9 g/kg。連續(xù)25 d，實驗期間，小鼠自由攝食及飲水[4]。

取（200±20）g Wister大白鼠 40只，按性別、體重隨機分為1個對照組和3個劑量組。分組后飼養(yǎng)觀察3 d后灌胃，對照組灌胃去離子水5 mL/d，試驗組灌胃大豆小分子肽溶液，3個劑量分別為每天3、6、9 g/kg。飼養(yǎng)50 d，實驗期間，大鼠自由攝食及飲水[5]。Wister種老齡大白鼠。取鼠齡為20個月，體重為（381.75±39.23）g Wister老齡雄性大白鼠20只，按體重隨機分為1個對照組和1個實驗組。分組后飼養(yǎng)觀察3 d后灌胃，對照組灌胃生理鹽水5 mL/d，試驗組灌胃大豆小分子肽溶液6.0 g/kg/d。飼養(yǎng)60 d，實驗期間，大鼠自由攝食及飲水[5]。

1.3 對小鼠游泳時間的影響

給樣第25 d后，小鼠灌胃0.5 h后，進行負重游泳實驗。小鼠右側(cè)臀負重6%，放入水溫（25±1）℃、水深40 cm的水槽中游泳，記錄小鼠從入水至運動疲勞發(fā)生時的游泳時間。小鼠頭部沒入水面以下7 s不再上浮判定為疲勞。記錄疲勞時間[6]。

1.4 對大白鼠各組SOD活性的影響[7]

大鼠連續(xù)給樣50 d后，分別剪斷股動脈，血用肝素抗凝，取肝臟用冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干，精確稱重，加入冰生理鹽水，玻璃勻漿器制成10%的組織勻漿，離心后吸取上清液備用。按微量鄰苯三酚快速測定紅細胞，肝臟的SOD活性。

1.5 對大白鼠各組SOD；GSH－Px活性和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量的影響[8]

大鼠連續(xù)給樣60 d后，分別剪斷股動脈，血用肝素抗凝，取肝臟用冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干，精確稱重，加入冰生理鹽水，玻璃勻漿器制成10%的組織勻漿，離心后吸取上清液備用。按微量鄰苯三酚快速測定紅細胞，肝臟的SOD活性。而GSH－Px活性和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量測定采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒。

1.6 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)輸入計算機，用SPSS 10.0 For Windows統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，統(tǒng)計處理數(shù)據(jù)用±s表示。組間比較用t檢驗，顯著性水平為（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 大豆小分子肽對游泳時間的影響

大豆小分子肽實驗組中高劑量組與對照組（生理鹽水組）相比，力竭游泳時間明顯延長，差異顯著（P＜0.05）。

表1 大豆小分子肽對游泳時間的影響Table 1 Effect of soybean minor peptides on mice exhaustive swimming time（±s）

表1 大豆小分子肽對游泳時間的影響Table 1 Effect of soybean minor peptides on mice exhaustive swimming time（±s）

組別 動物數(shù) 游泳時間（±s）/min對照組 15 41.7±6.3劑量組3.0 15 40.2±11.9 6.0 15 54.9±10.9*9.0 15 52.4±9.3*

2.2 大豆小分子肽對大白鼠各組SOD活性的影響

大豆小分子肽實驗組中的3個劑量組與對照組相比，中高劑量組的紅細胞（Hb）的SOD活性顯著增加（P＜0.05），但兩組沒有劑量相關(guān)性。而肝臟的SOD活性有增加趨勢，但兩組沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 大豆小分子肽對的紅細胞（Hb）肝臟的SOD活性影響nkatal（±s）Table 2 Effect of soybean minor peptides on activities of superoxide dismutase（SOD）of Hb and liver in the mice（±s）

表2 大豆小分子肽對的紅細胞（Hb）肝臟的SOD活性影響nkatal（±s）Table 2 Effect of soybean minor peptides on activities of superoxide dismutase（SOD）of Hb and liver in the mice（±s）

紅細胞（Hb） 肝臟（濕重）對照組 10 5.0（水） 248.05±47.34 205.96±72.01劑量組 10 3.0 217.21±32.67 216.54±57.51 10 6.0 353.23±53.18* 232.71±66.19 10 9.0 366.57±85.35* 220.54±52.01組別 動物數(shù) 劑量/（g/kg/d）SOD活性（±s）/（U/mg）

2.3 大豆小分子肽對老年大白鼠SOD活性的影響

大豆小分子肽實驗組與對照組相比，實驗組的紅細胞（Hb）SOD活性顯著增加（P＜0.05），而肝臟的SOD活性有增加趨勢，但兩組沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.4 大豆小分子肽對老年大白鼠谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）活性的影響

大豆小分子肽實驗組與對照組相比，實驗組的紅細胞（Hb）GSH－Px活性顯著增加（P＜0.05），而肝臟的

表3 大豆小分子肽對的紅細胞（Hb）肝臟的SOD活性影響nkatalTable 3 Effect of soybean minor peptides on activities of superoxide dismutase(SOD)of Hb and liver in old rats（±s）

表3 大豆小分子肽對的紅細胞（Hb）肝臟的SOD活性影響nkatalTable 3 Effect of soybean minor peptides on activities of superoxide dismutase(SOD)of Hb and liver in old rats（±s）

紅細胞（Hb） 肝臟（濕重）對照組 10 5.0 188.87±35.67 195.21±53.18劑量組 10 3.0 208.65±68.68* 217.04±48.68*組別 動物數(shù) 劑量/（g/kg/d）SOD活性（±S）/（U/mg）

表4 大豆小分子肽對的紅細胞（Hb）肝臟的GSH-Px活性影響nkatalTable 4 Effect of soybean minor peptides on activities of peroxidase（GSH—Px）of Hb and liver in old rats（±s）

表4 大豆小分子肽對的紅細胞（Hb）肝臟的GSH-Px活性影響nkatalTable 4 Effect of soybean minor peptides on activities of peroxidase（GSH—Px）of Hb and liver in old rats（±s）

組別 動物數(shù) 劑量/（g/kg/d）GSH－Px活性（±s）紅細胞（Hb） 肝臟（濕重）對照組 10 5.0 266.38±51.34 310.91±63.51劑量組 10 6.0 215.23±66.51* 329.90±49.01*

GSH－Px活性有增加趨勢，但兩組沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.5 大豆小分子肽對老年大白鼠的血紅細胞與肝臟組織中丙二醛含量的影響

表5 大豆小分子肽對的紅細胞（Hb）肝臟的丙二醛含量影響μmol/LTable 5 Effect of soybean minor peptides on the concentration of malondialdehyde（MDA）of Hb and liver in old rats（±s）

表5 大豆小分子肽對的紅細胞（Hb）肝臟的丙二醛含量影響μmol/LTable 5 Effect of soybean minor peptides on the concentration of malondialdehyde（MDA）of Hb and liver in old rats（±s）

組別 動物數(shù) 劑量/（g/kg/d）MDA 含量（±S）紅細胞（Hb） 肝臟（濕重）對照組 10 5.0 11.74±3.01 8.79±3.11劑量組 10 9.0 10.97±3.45 9.03±2.65

大豆小分子肽實驗組與對照組相比，實驗組的紅細胞（Hb）和肝臟中的MDA含量雖有降低的趨勢，但兩組沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

疲勞是由運動引起機體一系列生化改變而導(dǎo)致的肌肉力量的降低。評價疲勞的方法包括耐力試驗和生化指標的檢測。耐力試驗通過測定機體持續(xù)運動至力竭的時間可以反映機體的耐力[9]。標志疲勞發(fā)生的生化指標有以下幾類：（1）能量物質(zhì)，如血糖、肝糖原、肌糖原；（2）代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)，如酶、激素；（3）代謝產(chǎn)物，如血和肌肉中的乳酸、血尿素氮、丙酮酸等。只有運動時變化明顯，其變化程度與運動負荷及強度一致的指標才能作為疲勞的評價指標。儲存在肌肉中的糖原和葡萄糖，在無氧的條件下分解，終產(chǎn)物是乳酸。乳酸經(jīng)擴散進入血液，稱為血乳酸。然而在劇烈活動時，糖酵解供能系統(tǒng)成為供能的主要途徑。導(dǎo)致大量乳酸生成，血乳酸的濃度隨之增加。血液乳酸的含量與運動強度關(guān)系密切，血乳酸可作為評定運動強度的生化指標。糖是主要供能物質(zhì)。隨著負荷時間延長，能量供應(yīng)平衡遭到破壞；對糖能量儲備的需要越高，工作肌內(nèi)糖元儲備下降或不足，同時使蛋白質(zhì)水解酶活性升高，又促進蛋白質(zhì)分解代謝加強，合成速度明顯下降，其分解產(chǎn)物氨通過肝和腎轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩兀鹘?jīng)血液，使血中尿素濃度越來越高，故負荷越大，持續(xù)時間越長，血中尿素氮的濃度亦越高。同時當肌肉劇烈運動時，機體內(nèi)氧化作用大大加強，產(chǎn)生一系列氧自由基可導(dǎo)致肌肉和肝臟中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多而引起細胞或組織損傷，也是機體疲勞的原因之一[10]。

實驗結(jié)果表明：大豆小分子肽（分子量300 u～700 u）的中；高劑量組能明顯延長小鼠負重游泳時間，高劑量組具有明顯耐缺氧能力。并且高劑量組小鼠運動后血乳酸含量與對照組相比明顯降低。肝糖原；和血尿素氮含量與對照組相比差異不明顯（數(shù)據(jù)未列出），無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而中；高劑量組的大鼠的血紅細胞的超氧化物歧化酶（SOD）活力明顯高于對照（P＜0.05），而肝臟組織SOD酶活性有升高的趨勢，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。說明大豆肽具有一定的抗疲勞作用。有關(guān)活性肽的抗疲勞機制還不清楚，尚需進一步的研究。

目前一般認為，機體的衰老與自由基有很大的關(guān)系。機體在正常代謝過程中可以產(chǎn)生多種活性氧，如超氧陰離子（·O2－），羥自由基（·OH）、過氧化氫 H2O2）等，其中·OH與機體中的多不飽和脂肪酸（LH）作用，可以產(chǎn)生LPO。LPO的最終代謝產(chǎn)物，如小分子的醛、酮等可以與生物大分子作用，使其失去生理功能，最終導(dǎo)致機體損傷。生物體內(nèi)的抗氧化物酶，如SOD、GSH－Px可以清除活性氧，對生物體起保護作用，因此SOD、GSH—Px活性大小，LPO濃度的高低可反映出機體被氧化損傷的程度[11]。

丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化（脂褐素）LPO代謝物，其含量高低可反映體內(nèi)自由基的反應(yīng)程度，脂質(zhì)過氧化物可引起細胞代謝及功能障礙甚至死亡，故丙二醛（MDA）的含量常可間接反映出機體受自由基攻擊程度[12]。

實驗表明：大豆小分子肽可明顯增加血紅細胞（Hb）SOD、GSH—Px活性，而對肝組織中二酶的活性卻不明顯，對MDA含量的抑制作用亦不明顯。

有關(guān)活性肽的抗氧化機制還不清楚，可能是通過增加SOD，GSH－Px的活性，加快體內(nèi)自由基的清除，從而抑制肝臟內(nèi)過氧化脂質(zhì)的二級分解產(chǎn)物MDA的含量，有利于保護細胞免受過氧化損傷，對自由基有關(guān)的疾病有一定的防治作用。但具體是哪種物質(zhì)對抗氧化起主要作用，尚需進一步的研究[13]。

本實驗大豆小分子肽只能增加血紅細胞（Hb）SOD、GSH—Px活性，而對肝組織的活性卻不明顯，并對MDA含量幾乎沒有抑制作用。仍需進一步實驗研究來解釋。

肽類功能性食品被國內(nèi)外專家稱為21世紀食品。功能性食品是高附加值產(chǎn)品，關(guān)系到各年齡段人們的健康保健，市場潛力巨大。東北地區(qū)又是大豆的主產(chǎn)區(qū)，大豆小分子肽的開發(fā)可為食品工業(yè)提供了更為優(yōu)質(zhì)的食品輔料，同時為功能性食品的開發(fā)，提供了強大的物質(zhì)基礎(chǔ)。在實現(xiàn)經(jīng)濟和社會效益同時，又拉動了大豆種植業(yè)，激活了大豆初加工工業(yè)，也會促進交通運輸、水、電、煤等基礎(chǔ)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

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