酸駝乳中優勢乳酸菌的胃腸道耐受特性研究

朱曉瑩，買日艷姆古麗，古麗蘇木·托呼遜，努爾古麗·熱合曼

（新疆師范大學生命科學學院，新疆珍稀瀕危物種保護生物學實驗室，新疆烏魯木齊 830054）

益生菌也譯為“益生素、原生菌”等，意思為“有利于生命”，來源于拉丁文，是一類與宿主互利共生、有利于宿主健康的腸道生理細菌，組成明確的微生物制劑或產品，能通過定殖作用改變宿主某一部位菌群組成。Fuller將此定義修改為“能通過改善腸道微生物平衡而對宿主產生有益影響的微生物活體制品”[1]。乳酸菌是利用糖類進行發酵代謝，生成以乳酸為主的代謝產物細菌的總稱。研究發現，乳酸菌對人體有降膽固醇、降血壓和調節腸道微生態等多種保健作用[2]。

由于胃液的酸度非常大，通常的pH在3.0以下，對于微生物來說，這是一個極其嚴峻的環境，大部分乳酸菌在通過消化時到達腸道之前，因不能耐受胃液酸度而死亡，而少數菌能耐酸，只有少數耐酸的乳酸菌才能以活菌形式通過胃部。通過乳酸發酵，不僅食品的保存期得到了很大程度的延長，而且賜予其中乳酸菌一定的耐受性，尤其是在家庭式傳統發酵食品是耐受性較強的乳酸菌源泉。此類耐酸性乳酸菌能在人體中更有效地發揮保健作用，因此具有很大的開發價值。因此，開發出在強酸環境中也能較好存活的耐酸性乳酸菌，和擴大乳酸菌的應用范圍是息息相關的[3]。

本試驗通過體外耐酸、耐膽鹽實驗，從傳統發酵酸駝乳中的優勢乳酸菌中篩選出耐受性較強的優良益生特性較強的乳酸菌菌株。確定其能在被攝取過程中保持較高的存活以達到攝取后能較好發揮其保健效果。研究結果為開發出適合于駝乳發酵的益生發酵劑提供理論基礎，以便用于益生菌食品的開發。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 測試菌種來源

菌種：從傳統發酵酸駝乳樣品中分離鑒定的優勢乳酸菌。

1.1.2 培養基及試劑

MRS培養基；人工胃液：NaCl 0.2 g，胃蛋白酶（ICN Biomedicals）0.35 g溶于適量蒸餾水中，用HCl調節pH至2.0，定溶至100 mL，孔徑0.22 μm微孔濾膜（Millex－GV）過濾除菌[4－5]；0.3%牛膽鹽 MRS 培養基；pH7.4 的 PBS buffer。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌耐酸能力測定

待測菌株（30%甘油管保存）用MRS液體培養基37℃、2%的接種量進行乳酸菌的液體培養，無菌條件下取5 mL菌液離心，棄上清液；加入4 mL無菌生理鹽水洗滌后再離心，棄上清液；用4 mL，0.01 M，pH 7.4的PBS buffer再沖洗，離心，棄上清。沉淀中加入5 mL的人工胃液和1.5 mL PBS buffer，最終pH2.7振蕩均勻后放入37℃隨溫水浴鍋。充分混勻后放入37℃，隨溫水浴鍋；人工胃液加入0 h和恒溫2 h后2個時點，分別取樣稀釋涂平板，進行活菌計數，以測定2 h后菌的生存率，做3個平行求平均值[5]。

1.2.2 乳酸菌耐膽鹽能力的測定

將已活化12 h～14 h的待測菌液2%的接種量分別接種至MRS液體培養基和含膽鹽0.3%的MRS液體培養基中37℃靜置培養，分別在0 h、4 h和8 h取樣計數，比較兩種培養基中乳酸菌的生長狀況，并計算其存活率，做3個平行求平均值[6]。

存活率＝膽鹽MRS培養基cfu/mL普通/MRS培養基cfu/mL×100%。

2 結果與分析

2.1 酸駝乳乳酸菌在人工胃液中生長及其耐受性

本實驗從酸駝乳中分離乳酸菌中篩選出耐人工胃液比較強的耐酸性菌株有15個，其中5株為極耐酸菌株見圖1。

從圖1中可得，這些菌株經人工胃液處理2 h后活菌數還在108cfu/mL以上，其中M1－1②、Le2－1⑩、M1－2②、M3－1②以及 M3－1⑾等菌株對 pH 2.0 的人工胃液內也有增長的趨勢，因此這5株菌為極耐酸乳酸菌；，M3－3①、5－雙－球、Le2－1② 、Le2－1⑾、M4－1－5、Le3－3、M1－1③、M3－1、M4－3－2 雙球②、Le3－1①等菌株，經人工胃液處理后的活菌數雖然有下降的趨勢，但是還在107cfu/mL以上；此結果說明這些菌具有極強耐酸能力，并具有能夠通過胃，到腸道發揮益生作用的條件。結果活菌數107cfu/mL以上的，并誤差較小的15株菌作為耐酸菌；其它的菌株活菌數仍還在107cfu/mL以下，被認為不耐酸。

2.2 耐膽鹽能力的測定

將能在pH2的環境下存活的乳酸菌M1－1等15株試驗菌按所述的方法做0.3%牛膽酸鈉耐受性試驗，見圖2。

圖2結果顯示:試驗菌中存活率最高的是M3－3①、5－雙－球、Le3－3、M4－2 雙球、M3－3⑾、M1－4①等五株菌，其4 h后的活菌數量在107cfu/mL以上，則8 h后的活菌數量均在108cfu/mL以上；其次為M1－1②、Le2－1、M4－1－5、M1－1②M3－1⑾等四株菌，其 4 h 及 8 h后的增長數量在107以上；再次為M3－1②，其4 h及8h后的活菌數量均在107cfu/mL以下；菌株Le3－1①為不能耐受0.3%的牛膽酸鈉，其4 h后沒有增長趨勢。而在8 h后卻有負增長的現象。

測試菌耐受酸、耐受膽鹽具體結果見表1。

3 結論與討論

為使乳酸菌能在被攝取過程中保持較高的存活率以達到攝取后能較好發揮其保健效果的目的，通過耐酸試驗從不同的酸駝乳樣品中分離并篩選出耐pH2.0的人工胃液的15株菌株。根據16SrDNA序列測定結果可得，Lactobacillus brevis strain有2株，Enterococcus faecium strain有 2株，Leuconostoc lactis strain有 3株，Enterococcus sp.有 2株，Lactobacillus sakei strain有 2株，Enterococcus durans strain有 1株，15株菌有5株為極耐酸，Enterococcus durans strain，8株為中度耐酸，還有2株為低度耐酸說明植物性乳酸菌有較強的耐酸性。

表1 既能耐受酸又能耐受膽鹽的菌株Table 1 The acid and bile tolerance strains

乳酸菌的抗菌、抗癌等益生特性一方面在于它對一些外來的致病菌以及病變細胞具有生物屏障作用，即乳酸菌與腸黏膜上皮細胞相互作用、密切結合構成了生物學屏障；在此同時，通過其自身及其代謝物與其它細菌之間的相互作用，調整菌群之間的關系，維持和保證菌群最佳優勢組合以及這種組合的穩定性，從而阻止了致病菌的入侵和定殖，拮抗致病菌和有害微生物的生長及其毒素的黏附。以上益生作用的前提是益生菌（probiotic）必須能夠耐受胃和腸道的消化過程，所以用作益生菌的菌株必須能耐受酸和膽鹽的作用，能黏附十腸黏膜上皮細胞并能定植[7]。

乳酸菌的耐酸及耐膽汁鹽能力，能順利通過胃腸道而定植于大腸內，與其益生作用息息相關。當其達到一定數量時，才能夠起到健康促進效果。Kurmann等報道，乳酸菌發揮功能特性的活菌數臨界值為106cfu/mL或106cfu/g，一般流體食物在胃內停留的時間1 h～2 h。諸多報道顯示，不同益生乳酸菌菌株對低pH的耐受能力存在一定差異。Smith研究發現，通過飲水給野兔分別喂109cfu/mL的多種菌，大腸桿菌、糞鏈球菌、魏氏梭菌、嗜酸乳桿菌，飼喂24 h后宰殺，胃內容物pH為1.2，能檢測到嗜酸乳桿菌，未測到其它3種菌，說明乳酸菌比其它菌更能耐受較低的pH環境而在動物體內生存。Conway等的研究結果表明嗜酸乳桿菌在pH為3.0，0 h菌數量為108cfu/mL，2 h為105cfu/mL[8]。

益生乳酸菌要順利進入動物腸道，除具有可耐受胃中低pH的能力外，還需具備耐受小腸中膽汁等形成的高滲透壓環境的能力。已有報道表明，一些乳酸菌具有一定的膽鹽耐受能力。顧瑞霞等發現，Bifidobacterium infantis，Lactobacillzts acidophilatsCH2，L.bulgaricus CH2，S.thermophilzts CH2四種乳酸菌對膽鹽的耐受能力較好[9]。趙瑞香等研究表明，在0.3%膽鹽濃度下培養4 h后L.acidophilits Ind-I存活率為0.32%[3]。本研究中耐酸試驗選用pH 2條件，耐膽鹽試驗中膽鹽選用0.3%牛膽酸鈉。試驗結果表明，從35株實驗菌株中，篩選出來的15株菌株中在pH為2.0的條件下，4 h后除了菌株Le3-1之外，其它14株菌的耐酸存活率在36.51%以上，活菌數均為107cfu/mL以上，遠遠超過了臨界值。15株耐酸乳酸菌中除了Le3-1①外，其它14株菌株均有一定的耐膽鹽能力。此結果因此證明了這些菌株能夠順利通過胃酸環境而達到腸道內，具備功能性食補因子的基本要求。

本研究結果得到的乳酸菌無需在不同酸度既不同膽鹽濃度的培養基中馴化，就有較強的耐酸既膽鹽耐受性，這一結果這些菌株的特殊生境有密切的關系，即當地牧民嗜酸度比較高的發酵奶，而且此類發酵乳制品的發酵劑也是已發酵的奶，他們不做酸駝奶時，低溫保存已發酵的酸駝奶；這種制作工藝恰恰給其里面的乳酸菌賜予自然馴化的生態環境，因此這些乳酸菌具有一定的耐受性。這些菌株在進一步確定其它益生作用能力后，可應用于益生發酵劑組分及人體不同的微生態制劑。

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