左歸丸含藥血清通過JNK信號通路誘導MC3T3成骨細胞分化的研究

劉立萍， 任艷玲*， 李 然， 王智民， 蒿長英， 宋 囡

(1.遼寧中醫藥大學 基礎醫學院，遼寧 沈陽 110847;2.遼寧中醫藥大學 第一臨床學院，遼寧 沈陽 110847)

絕經后婦女易患骨質疏松癥，對于絕經后骨質疏松癥的防治日益受到人們的關注，現代研究表明中醫藥在絕經后骨質疏松癥的藥物治療方面取得了不少成果，中醫藥臨床治療以“補腎”為法，能提高骨量，緩解或消除癥狀，并起到綜合治療目的［1］。中成藥左歸丸具有滋腎補陰功效，本課題組前期研究結果表明左歸丸對去卵巢所致絕經后骨質疏松癥大鼠有一定的防治作用［2］，為了進一步探討左歸丸治療絕經后骨質疏松癥的作用機制，本實驗探討JNK信號通路對左歸丸含藥血清調控MC3T3成骨細胞分化的影響。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級SD雌性大鼠60只，(200±20)g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，許可證號:SCXK(滬)2008-0016。

1.2 細胞培養 MC3T3-E1 Subclone 14，由中國科學院上海生命科學研究院提供。MC3T3成骨細胞用含10%FBS的α-MEM培養液培養，每周換2次培養液，37℃、5%CO2培養箱內孵育。

1.3 藥物與試劑 左歸丸 (上海雷允上封浜制藥有限公司，國藥準字Z31020371);倍美力結合雌激素片 (愛爾蘭惠氏藥廠，國藥準字J20050120);SP600125(Sigma);PNPP(Sigma);茜素紅(Sigma);抗ALP抗體 (博士德);抗GAPDH抗體(北京中杉)。

1.4 主要儀器 iMark型酶標儀 (Bio-Rad);Trans-Blot SD半干轉印系統 (Bio-Rad);EC3凝膠成像儀 (UVP)。

2 方法

2.1 含藥血清的制備 大鼠按體質量隨機分為3組，空白對照組、左歸丸組、倍美力組，20只/組。根據人與大鼠等劑量換算公式折算大鼠左歸丸的等臨床劑量為1.6 g/kg體質量，倍美力為56.25 μg/kg。藥物灌服10 mL/kg，空白對照組灌服蒸餾水，2次/d，于第8天給藥2 h后，腹主動脈取血，離心取上清，56℃滅活30 min。

2.2 細胞實驗分組 依據不含或含JNK特異抑制劑SP600125(10 μmol/L)，將實驗分為空白對照組、SP600125組、左歸丸組、左歸丸加SP600125組、倍美力組、倍美力加SP600125組。

2.3 細胞抑制劑預處理及給藥 細胞接種24 h后，換用含0.2%FBS的α-MEM培養液饑餓24 h，棄培養液，加入不含或含10 μmol/L SP600125的α-MEM培養液預處理60 min后，各組加入終濃度為15%的相應含藥血清孵育。

2.4 堿性磷酸酶活性測定 細胞以1×105接種于48孔培養板，抑制劑預處理及給藥，孵育48 h后，0.1%Triton X-100裂解液4℃作用過夜，反復凍融3次，冰水浴內超聲，收集裂解液。BCA法測定蛋白濃度，采用PNPP法測定ALP活性，測定孔內加入基質溶液 (2 mol/L二乙醇胺緩沖液，PNPP)，37℃孵育15 min，加入0.5 mol/L NaOH終止反應，酶標儀上415 nm測定吸光度 (A)。

2.5 改良鈣鈷法染色 細胞以1×105接種于24孔板，抑制劑預處理及給藥，孵育7 d，每3天換1次液。95%乙醇固定10 min，PBS洗，加入孵育液 (2%氯化鈣20 mL、2%巴比妥鈉10 mL、3%β-甘油磷酸鈉10 mL、5%硫酸鎂5 mL、蒸餾水 5 mL)，37℃ 孵育4 h，去離子水沖洗，2%硝酸鈷溶液5 min，去離子水沖洗，1%硫化銨溶液1 min，去離子水沖洗。

2.6 茜素紅染色 細胞以1×105接種于24孔板，抑制劑預處理及給藥，孵育14 d，每3天換1次液。95%乙醇固定10 min，PBS洗，0.1%茜素紅-Tris-Hcl(pH8.3)，37℃，避光孵育30 min，去離子水沖洗。

2.7 Western blot分析 細胞以2×106接種于25 cm2培養瓶，抑制劑預處理及給藥，孵育48 h。提取總蛋白，BCA測定蛋白濃度，提取液中加入5×SDS上樣緩沖液，100℃變性5 min，蛋白上樣60 μg/孔，12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉膜3 h，5%脫脂奶粉封閉1 h。一抗4℃孵育過夜，二抗37℃孵育2 h，ECL發光。實驗結果采用quantity one軟件分析，掃描光密度值。

2.8 統計分析 計量數據采用SPSS 10.0軟件處理，用One-Way ANOVA進行分析，數據以表示。

3 結果

3.1 JNK抑制劑對左歸丸含藥血清干預MC3T3細胞48 h ALP活性的影響 由圖1可見，與對照組比較，左歸丸組和倍美力組均顯著增強MC3T3細胞ALP活性 (P＜0.01);與左歸丸組比較，左歸丸加SP600125組對孵育48 h的ALP活性影響不顯著，左歸丸組優于倍美力組 (P＜0.05);與倍美力組比較，倍美力加SP600125組顯著對抗倍美力含藥血清對ALP活性的誘導 (P＜0.01)。

圖1 JNK抑制劑對左歸丸含藥血清干預MC3T3細胞48 h ALP活性的影響(±s，n=5)Fig.1 Effects of inhibitor of JNK on Zuogui Pill-induced ALP activity within 48 h in MC3T3 cells(±s，n=5)

3.2 JNK抑制劑對左歸丸含藥血清干預MC3T3細胞7 d ALP活性的影響 由圖2可見，與對照組比較，左歸丸組和倍美力組均顯著增強MC3T3細胞ALP活性 (P＜0.01);與左歸丸組比較，左歸丸加SP600125組對孵育7 d的ALP活性誘導明顯減弱 (P＜0.01)，且左歸丸組優于倍美力組 (P＜0.05);與倍美力組比較，倍美力加SP600125組顯著對抗倍美力含藥血清對ALP活性的誘導 (P＜0.01)。

3.3 JNK抑制劑對左歸丸含藥血清干預MC3T3細胞14 d礦化作用的影響 由圖3可見，與對照組比較，左歸丸組和倍美力組均顯著增強MC3T3細胞礦化作用 (P＜0.01);與左歸丸組比較，左歸丸加SP600125組對孵育14 d的礦化作用誘導明顯減弱 (P＜0.01)，且左歸丸組優于倍美力組 (P＜0.05);與倍美力組比較，倍美力加SP600125組顯著對抗倍美力含藥血清對礦化作用的誘導 (P＜0.01)。

圖2 JNK抑制劑對左歸丸含藥血清干預MC3T3細胞7 d ALP活性的影響(±s，n=3)Fig.2 Effects of inhibitor of JNK on Zuogui Pills-induced ALP activity within 7 d in MC3T3 cells(±s，n=3)

圖3 JNK抑制劑對左歸丸含藥血清干預MC3T3細胞14 d礦化作用的影響(±s，n=3)Fig.3 Effects of inhibitor of JNK on Zuogui Pills-induced mineralization within 14 d in MC3T3 cells(±s，n=3)

3.4 JNK抑制劑對左歸丸含藥血清干預MC3T3細胞ALP蛋白表達的影響 由圖4可見，與對照組比較，左歸丸組和倍美力組均顯著上調MC3T3細胞ALP蛋白的表達水平 (P＜0.01);與左歸丸組比較，左歸丸加SP600125組對孵育48 h的ALP蛋白表達的影響不顯著，左歸丸組優于倍美力組 (P＜0.01);與倍美力組比較，倍美力加SP600125組顯著對抗倍美力含藥血清對ALP蛋白表達的上調作用 (P＜0.01)。

圖4 JNK抑制劑對左歸丸含藥血清干預MC3T3細胞ALP蛋白表達的影響(±s，n=3)Fig.4 Effect of of inhibitor of JNK on Zuogui Pills-induced expression of ALP protein in MC3T3 cells(±s，n=3)

4 討論

絕經后骨質疏松癥是以絕經后婦女骨量減少，易發生骨折為主要特征的病癥，治以補腎、健脾等法，多選用補益劑，尤以入腎經最多［3］。具有補腎作用的中成藥發揮防治骨質疏松作用［4］，滋補腎陰對腎陰虛型絕經后骨質疏松癥治療效果確切［5］，左歸丸(《景岳全書》)為滋陰補腎之常用方劑，現代研究表明左歸丸能夠有效防治絕經后骨質疏松癥［6-7］。

成骨細胞分化是骨形成的重要部分，其特異性標志有ALP表達，Ⅰ型膠原積累，骨鈣素產生，骨基質礦化。骨形成時成骨細胞可分泌大量ALP，ALP活性可以反映成骨細胞的活躍狀況［8］，骨礦化階段主要是鈣和磷酸鹽合成［9］。本研究實驗結果提示左歸丸含藥血清既能顯著誘導MC3T3細胞分化前期的ALP活性，上調ALP蛋白表達水平，又能刺激成骨細胞分化末期的礦化結節形成，促進MC3T3成骨細胞分化。

促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK)信號通路對于MC3T3成骨細胞連續分化起著重要作用，成纖維細胞生長因子-2(FGF-2)誘導JNK蛋白磷酸化［10］，活化JNK參與BMP-2誘導的骨基質礦化［11］，SP600125阻 滯 JNK 通 路，顯 著 抑 制MC3T3成骨細胞分化末期礦化作用，對成骨細胞分化早期階段ALP活性表達影響不顯著［12］。本實驗研究結果表明SP600125阻滯JNK通路，對左歸丸含藥血清孵育48 h誘導的MC3T3成骨細胞分化前期的ALP活性和ALP蛋白表達的影響不顯著，對孵育7 d的ALP活性和14 d的礦化結節的影響顯著。結果提示左歸丸含藥血清誘導MC3T3成骨細胞分化末期尤其依賴JNK通路促進骨形成，這可能是左歸丸防治絕經后骨質疏松癥的機制之一，對于左歸丸含藥血清誘導MC3T3成骨細胞分化前期ALP活性是否主要通過p38或ERK通路值得進一步研究。

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