HPLC-UV-MS法同時測定痹祺膠囊中7個有效成分

經雅昆， 江振作， 劉亞男， 王躍飛

(天津市中藥化學與分析重點實驗室，天津中醫藥大學，天津300193)

痹祺膠囊源于漢代名醫華佗的傳世驗方“一粒仙丹”，1983年天津達仁堂制藥二廠在該秘方的基礎上結合現代科技重新組方，研制出抗風除濕新藥——痹祺膠囊。痹祺膠囊是由馬錢子、川芎、甘草、丹參、白術、三七、黨參等十味中藥組成的復方制劑，具有益氣養血，祛風除濕，活血止痛之功效，臨床用于氣血不足，風濕阻滯，肌肉關節酸痛，關節僵硬變形等風濕、類風濕性關節炎、肩周炎、頸椎病、腰椎間盤突出癥等疾病［1］。方中馬錢子苦寒，具有散結消腫，通絡止痛之功［2］，士的寧和馬錢子堿是其主要有效成分;丹參活血化瘀、通絡止痛［3-6］，主要成分為丹酚酸B、丹參酮ⅡA和隱丹參酮;甘草調和諸藥［7］，甘草苷和甘草酸為其主要成分。目前，大多數文獻主要圍繞痹祺膠囊的藥理、毒理作用和臨床應用開展研究工作［8］，痹祺膠囊質量控制方面的研究文獻報道較少，主要以痹祺膠囊中士的寧、馬錢子堿和丹酚酸B為檢測指標開展質量控制研究［9-10］。本研究在此基礎上建立了一種同時測定痹祺膠囊中士的寧、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隱丹參酮和丹參酮ⅡA7個活性成分含有量的方法，能夠更全面地評價痹祺膠囊的質量。

1 儀器與試劑

Finnigan LCQ Deca XPplus質譜儀 (美國 Finnigan公司)，Agilent 1100型高效液相色譜儀 (美國Agilent公司)，由二極管陣列檢測器 (DAD)、柱溫箱、四元梯度泵、自動進樣器、在線真空脫氣機組成，Agilent ChemStation數據處理系統;BP121S萬分之一天平 (德國塞多利斯公司);METTLER TOLEDO AX205(瑞士)十萬分之一天平;KQ—250E型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);2—16A高速離心機 (美國Tomos公司)。

對照品士的寧 (批號:110705-200306)、馬錢子堿 (批號:110706-200505)、甘草苷 (批號:111610-201005)、丹 酚 酸 B(批 號:111562-200908)、隱丹參酮 (批號:110852-200305)和丹參酮ⅡA(批號:110766-200619)均購于中國食品藥品檢定研究院，甘草酸購自天津中新藥業研究中心，藁本內酯購自天津馬克生物技術有限公司，純度≥98%。

7個批次的痹祺膠囊由天津達仁堂京萬紅藥業有限公司提供。

甲醇和乙腈 (色譜純，MEREK);甲酸 (色譜純，TEDIA);Millipore超純水。

2 方法與結果

2.1 液相色譜、質譜條件 Agilent Zorbax C18色譜柱 (4.6 mm×100 mm，1.8 μm);以乙腈 (A)-0.1%甲酸水溶液 (B)為流動相，梯度洗脫 (0～50 min，7% ～85%A);體積流量0.5 mL/min;檢測波長為260 nm(0～16 min)，286 nm(16.01～23 min，250 nm(23.01 ～28min)，278nm(28.01～40 min)，270 nm(40.01～50 min);柱溫40℃;進樣量5 μL。

離子檢測模式為0～14 min:正離子檢測模式;14～28 min:負離子檢測模式;28～50 min:正離子檢測模式;ESI噴霧電壓 ±4.5 kV;鞘氣 (N2)壓力為276kPa;輔助氣 (N2)體積流量3.3 L/min;毛細管溫度350℃;毛細管電壓 ±19 V;掃描范圍m/z100～850 amu。

2.2 對照品貯備液的制備 精密稱取士的寧、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、藁本內酯、隱丹參酮和丹參酮ⅡA對照品適量，置于棕色量瓶中，加甲醇配制成每1 mL含士的寧、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、藁本內酯、隱丹參酮和丹參酮ⅡA分別為 0.84、1.10、0.68、1.01、1.02、1.06、1.26、1.00 mg的對照品貯備液，于4℃保存。

2.3 供試品溶液的制備 取痹祺膠囊粉末0.5 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入75%甲醇25 mL，稱定質量，超聲提取30 min，放至室溫后，再次稱質量，用75%甲醇補足減失的質量，搖勻，14 000 r/min離心10 min，取上清液即得供試品溶液。

2.4 陰性樣品溶液的制備 取痹祺膠囊中除馬錢子、川芎、丹參和甘草以外的其他藥材，按處方劑量及制法和工藝要求制備缺馬錢子、川芎、丹參和甘草的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法，制得陰性樣品溶液。

2.5 化合物的定性分析 在優化的色譜和質譜條件下，取痹祺膠囊的對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液進樣分析，得到痹祺膠囊8個成分混合對照品色譜圖 (圖1-A)、供試品色譜圖 (圖1-B)、陰性樣品色譜圖 (圖1-C)及痹祺膠囊供試品的質譜總離子流 (TIC)圖 (圖1-D)。由圖1-C可知陰性樣品對士的寧、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的測定無干擾，對藁本內酯 (圖1中峰a)的測定有干擾，舍去藁本內酯。由圖1-B可知，供試品中被測成分與相鄰組分的分離度R＞1.5，達到基線分離。通過比較痹祺膠囊供試品和對照品的色譜保留時間(tR)和ESI(+/-)MS數據，確定色譜峰1～7分別為士的寧、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隱丹參酮和丹參酮ⅡA。7個化合物的質譜信息見表1。

圖1 對照品 (A)、供試品 (B)、陰性樣品 (C)HPLC色譜圖及供試品 (D)TIC圖Fig.1 Chromatograms of mixed reference substances(A)，sample(B)，negative sample(C)and total ion-current chromatogram of sample(D)

表1 痹祺膠囊樣品中7個化學成分的ESI(+/－)MS數據Tab.1 Data of ESI(+/－)MS of seven components in Biqi Capsules

2.6 線性關系、定量限、檢測限試驗 分別準確移取2.2項各對照品貯備液適量，置于同一10 mL量瓶中，用甲醇稀釋得士的寧、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隱丹參酮和丹參酮ⅡA質量濃度分別為 61.48、32.93、113.1、228.5、271.4、3.353、6.653 μg/mL 的混合對照品溶液，并逐級稀釋成一系列不同質量濃度的對照品溶液，進樣5 μL測定。以對照品質量濃度X(μg/mL)對峰面積Y進行線性回歸。以信噪比3∶1為檢測限，以信噪比10∶1為定量限，按2.1項所述色譜條件進樣分析。結果見表2，7個化合物在各自的質量濃度范圍內線性關系良好。

表2 7個化合物的回歸方程、相關系數、線性范圍、檢測限和定量限Tab.2 Regression equations，correlation coefficients，linear ranges，LODs and LOQs of seven components in Biqi Capsules

2.7 精密度試驗 按2.3項下方法制備供試品溶液，2.1項所述色譜條件連續進樣6次測定，連續進樣3 d，記錄士的寧、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的峰面積，計算7個成分的日內精密度和日間精密度，結果見表3。表明精密度良好。

表3 7個化合物的日內精密度 (n=6)和日間精密度 (n=3)Tab.3 RSD values of intra-day and inter-day precision of seven components

2.8 穩定性試驗 按2.3項下方法制備供試品溶液，2.1項所述色譜條件分別于0、3、6、9、12 h進樣5 μL測定，考察供試品溶液的穩定性。士的寧、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隱丹參酮和丹參酮ⅡA峰面積的RSD值分別為0.37%、0.57%、 0.46%、 0.36%、 0.30%、 1.66%、0.80%。結果表明供試品溶液室溫放置12 h基本穩定。

2.9 重復性試驗 按2.3項下方法制備供試品溶液，平行處理6份，在2.1項所述色譜條件下每份連續進樣2次測定，記錄士的寧、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的峰面積，計算質量分數分別為0.756 2、0.514 8、1.190、2.671、3.694、0.041 9、0.086 9 mg/g;RSD值分別為2.04%、1.86%、0.87%、1.00%、0.81%、2.14%、1.26%。表明本方法重復性好。

2.10 加樣回收率試驗 取痹祺膠囊藥粉0.25 g，精密稱定，共6份，準確加入與樣品中含有量相當的士的寧、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隱丹參酮和丹參酮ⅡA對照品貯備液，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項所述色譜條件分別每份連續進樣2次測定，計算加樣回收率，結果見表4。

表4 7個化合物加樣回收率試驗結果 (n=6)Tab.4 Average recoveries of seven components(n=6)

2.11 樣品測定 另取7個批次的痹祺膠囊。按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定。計算痹祺膠囊中7個化學成分的質量分數，結果見表5。結果表明:痹祺膠囊中有毒成分士的寧和馬錢子堿在制劑中的質量分數比較穩定;丹酚酸B和甘草酸的質量分數相對較高，隱丹參酮和丹參酮ⅡA質量分數相對偏低。

表5 痹祺膠囊中7個化學成分測定結果(±s，n=3)Tab.5 Content of seven components in seven batches of Biqi Capsules(±s，n=3)

表5 痹祺膠囊中7個化學成分測定結果(±s，n=3)Tab.5 Content of seven components in seven batches of Biqi Capsules(±s，n=3)

批次 士的寧/(mg·g-1)馬錢子堿/(mg·g-1)甘草苷/(mg·g-1)丹酚酸B/(mg·g-1)甘草酸/(mg·g-1)隱丹參酮/(mg·g-1)丹參酮ⅡA/(mg·g-1)1 0.890±0.040 0.569±0.004 0.771±0.060 4.435±0.123 1.786±0.033 0.038±0.001 0.110±0.004 2 0.840±0.040 0.546±0.001 0.693±0.001 2.446±0.016 3.300±0.022 0.247±0.001 0.354±0.002 3 0.790±0.040 0.593±0.006 0.753±0.007 2.982±0.011 3.477±0.008 0.224±0.001 0.317±0.001 4 0.881±0.040 0.566±0.003 0.723±0.003 2.884±0.012 3.344±0.008 0.260±0.002 0.355±0.001 5 0.870±0.040 0.559±0.007 0.744±0.003 2.977±0.026 3.466±0.032 0.259±0.001 0.357±0.001 6 0.819±0.040 0.525±0.012 1.004±0.012 3.188±0.030 2.414±0.037 0.226±0.003 0.320±0.003 7 0.840±0.040 0.541±0.003 0.986±0.001 3.116±0.008 2.438±0.007 0.225±0.001 0.317±0.001 RSD/% 4.32 3.98 15.82 19.58 23.22 37.00 28.81

3 討論

3.1 提取條件的選擇 采用單因素循環的方法，分別考察了提取溶劑 (50%、75%、100%甲醇)、提取溶劑倍數 (50倍、100倍、200倍)、提取時間 (10、20、30、60 min)的提取效率。綜合考慮提取效率和溶劑用量，選擇50倍量75%甲醇超聲提取30 min。

3.2 檢測指標的選擇 馬錢子在處方中起著重要作用，具有通絡止痛、散結消腫的功效。士的寧和馬錢子堿既是其中主要有效成分，也是有毒成分［11-12］，因此士的寧和馬錢子堿是痹祺膠囊質量控制的關鍵指標。丹參活血化瘀、通絡止痛，主要成分為丹酚酸B、丹參酮ⅡA和隱丹參酮;甘草調和諸藥，甘草苷和甘草酸為其主要成分。綜上所述，本實驗選取士的寧、馬錢子堿、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸、隱丹參酮和丹參酮ⅡA作為檢測指標，能更全面反映痹祺膠囊的質量，保證臨床用藥的安全性和有效性。

3.3 檢測波長的選擇 由于本實驗選取的7個檢測指標的最大吸收波長不同，因此為了達到檢測靈敏度高、干擾小且真實反映痹祺膠囊各個有效成分含有量的目的，采用波長切換的方法。結合各化合物的最大吸收波長和出峰時間，利用二級陣列管檢測器波長切換的功能，確定了檢測波長。

3.4 質譜離子模式的選擇 由于本實驗選取的7個檢測指標在正、負離子模式的響應不同:士的寧、馬錢子堿、甘草苷、隱丹參酮和丹參酮ⅡA在正離子檢測模式下響應高;丹酚酸B、甘草酸在負離子檢測模式下響應高，最終確定離子檢測模式為0～14 min:正離子檢測模式;14～28 min:負離子檢測模式;28～50 min:正離子檢測模式。

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