新安軟膠囊質(zhì)量標準研究

肖會敏， 何 悅， 楊 倩， 王四旺， 王劍波， 謝艷華

(第四軍醫(yī)大學藥學院藥物研究所，陜西西安710032)

新安軟膠囊主要由椒目、水飛薊素等組成。椒目采用超臨界二氧化碳萃取，經(jīng)純化得到椒目仁油［1］，水飛薊素經(jīng)過乙醇純化精制得水飛薊賓［2］。椒目仁油的主要成分是不飽和脂肪酸即油酸、亞油酸與α-亞麻酸等［3-4］;椒目仁油對大鼠、小鼠及家兔等高血脂模型均具有防治作用，認為是通過降低血脂水平、血細胞比容、紅細胞聚集指數(shù)、調(diào)節(jié)和改善脂質(zhì)代謝及血流變動力學指標等來實現(xiàn)，并對肝細胞具有一定的保護作用［3-6］。水飛薊素的主要成分為水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊寧、水飛薊亭，其中以水飛薊賓的含有量最高，其具有抗肝炎、保肝利膽、降血脂、防治動脈粥樣硬化、抗血小板凝集等作用［7-8］。為有效控制制劑質(zhì)量，本實驗對該制劑進行了質(zhì)量標準的研究。

1 儀器與試藥

氣相色譜儀，Agilent 4890D型，美國安捷倫公司;高效液相色譜儀，配2695分離單元，2996二極管陣列檢測器，Empower色譜工作站，自動進樣器，美國Waters公司;對照品:α-亞麻酸 (批號111631-200802)，油酸 (批號111621-200608)，亞油酸 (批號111622-200602)，水飛薊賓對照品(批號752-200108，供含量測定用)，均購自中國藥品生物制品檢定所;新安軟膠囊，批號20091209、20091216、20091223，由第四軍醫(yī)大學藥物研究所研制;內(nèi)標:十四酸，純度98%，批號21801，上海晶純化學試劑有限公司;三氟化硼乙醚，化學純，批號20050426，國藥集團化學試劑有限公司;甲醇，色譜純，美國 Honeywell公司;冰醋酸，色譜純，天津市科米歐化學試劑開發(fā)中心;硅膠G板，青島海洋化工;其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 油酸、亞油酸和α-亞麻酸的測定［3］

2.1.1 色譜條件 以丁二酸二乙二醇聚酯(DEGS)為固定相，涂布濃度為15%不銹鋼填充柱，柱長2 m，內(nèi)徑3 mm;柱溫180℃;恒溫;進樣口溫度300℃;檢測器為氫焰離子化檢測器，溫度320℃;載氣為高純氮，體積流量40 mL/min;燃氣為氫氣，體積流量40 mL/min;空氣，體積流量400 mL/min;進樣量為1 μL;分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于1 000。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取油酸對照品46.04 mg、亞油酸對照品34.10 mg、α-亞麻酸對照品24.36 mg各置于100 mL錐底燒瓶中，加30 mL 0.5 moL/L氫氧化鉀-甲醇溶液，置于氮氣保護下65℃水浴回流30 min，用流水使冷卻后，加10 mL三氟化硼乙醚液，再回流5 min，用流水使冷卻后，加入3 mL正己烷，10 mL飽和氯化鈉溶液，旋渦振搖，放置片刻，吸出上層置于5 mL量瓶中，加正己烷至刻度，作為對照品母液。

2.1.3 內(nèi)標溶液的制備 以十四酸作為內(nèi)標，精密稱取7.35 mg，按2.1.2項對照品溶液制備的方法制備，得質(zhì)量濃度為1.47 mg/mL，作為內(nèi)標溶液。

2.1.4 供試品溶液的制備 取10粒軟膠囊內(nèi)容物，剪開，傾出內(nèi)容物，混合均勻，稱取內(nèi)容物50 mg，十四酸3 mg，分別精密稱定，置于25 mL錐底燒瓶中，加5 mL 0.5 moL/L氫氧化鉀-甲醇溶液，置于氮氣保護下65℃水浴回流30 min，用流水使冷卻后，加2 mL三氟化硼乙醚液，再回流5 min，用流水使冷卻后，精密加入2 mL正己烷，5 mL飽和氯化鈉溶液，旋渦振搖，放置片刻，吸出上層，作為供試品溶液。

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密量取對照品母液0.200、0.275、0.550、0.625、1.250 mL，分別各置于2 mL量瓶中，氮氣吹干，分別各加入0.5 mL內(nèi)標溶液，溶解，即得，分別進樣。以油酸、亞油酸、α-亞麻酸的峰面積對十四酸的峰面積的比值(Y1，Y2，Y3)分別對油酸、亞油酸、α-亞麻酸的質(zhì)量濃度 (X1，X2，X3)做線性回歸，得方程為Y1=0.640 5X1+0.155 1，相關(guān)系數(shù)r1為0.999 8;Y2=0.550 2X2+0.094 1，相關(guān)系數(shù)r2為0.999;Y3=0.523 4X3+0.041 4，相關(guān)系數(shù)r3為0.999，說明油酸、亞油酸、α-亞麻酸的峰面積分別在3.68～23.02 mg/mL、2.728～17.050 mg/mL、1.95～12.18 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，見圖1。

圖1 不飽和脂肪酸對照品GC圖Fig.1 GC chromatogram of unsaturated fatty acid reference standards

2.1.6 校正因子的測定 根據(jù)標準曲線中油酸、亞油酸、α-亞麻酸和十四酸的峰面積計算校正因子分別為1.03(RSD值為1.73%)、1.21(RSD值為2.90%)、1.28(RSD值為2.62%)。

2.1.7 精密度實驗 取線性考察樣品溶液(0.625 mL母液吹干，加0.5 mL內(nèi)標液)連續(xù)進樣6次，測定峰面積比值。油酸、亞油酸、α-亞麻酸的峰面積對十四酸峰面積比值的RSD值分別為2.73%、2.47%、2.61%，結(jié)果表明該法精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性實驗 取線性考察樣品溶液(0.625 mL母液吹干，加0.5 mL內(nèi)標液)，按0、2、4、8、12、24 h時間點進樣測定，油酸、亞油酸、α-亞麻酸的峰面積對十四酸的峰面積的比值的RSD值分別為1.74%、1.74%、1.53%，結(jié)果表明該法在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 新安軟膠囊樣品加樣回收率實驗 采用加樣回收法，取已測知含有量的新安軟膠囊 (批號20091209，樣品中油酸、亞油酸、α-亞麻酸質(zhì)量分數(shù)分別為19.98%、29.31%、35.88%)，分別添加油酸、亞油酸、α-亞麻酸對照品，按供試品溶液制備法操作，按上述色譜條件進行測定，結(jié)果油酸、亞油酸、α-亞麻酸平均加樣回收率及其RSD值分別為 98.37%、0.65%，98.89%、0.31%，99.20%、0.60%，表明本方法具有良好的回收率。

2.1.10 重復性實驗 取新安軟膠囊 (批號20091209，樣品中油酸、亞油酸、α-亞麻酸質(zhì)量分數(shù)分別為19.98%、29.31%、35.88%)，按照供試品方法制備6份樣品，進樣測定，結(jié)果油酸、亞油酸、α-亞麻酸質(zhì)量分數(shù)的RSD值分別為3.66%、1.56%、3.16%，表明本方法穩(wěn)定。

2.1.11 3批新安軟膠囊測定 根據(jù)2.1.6項校正因子的測定計算。根據(jù)2.1.4項供試品溶液制備方法制備供試品溶液。精密吸取1 μL，注入氣相色譜儀，測定，根據(jù)校正因子按內(nèi)標法計算，結(jié)果見表1，圖2。

表1 3批新安軟膠囊樣品中不飽和脂肪酸測定結(jié)果Tab.1 Determination results of unsaturated fatty acids in three batches of Xin'an Soft Capsules samples

2.2 水飛薊賓的測定［8-9］

2.2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱 (5 μm，4.6 mm×250 mm);流動相為甲醇-1%冰醋酸(50∶50);檢測波長288 nm;柱溫35℃;體積流量1.0 mL/min，進樣量5 μL;分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于5 000。

2.2.2 供試品溶液的制備 取10粒軟膠囊內(nèi)容物，剪開，傾出內(nèi)容物，混合均勻，稱取70 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇適量并超聲使分散，靜置，澄清后用甲醇稀釋至刻度。

2.2.3 空白對照溶液的制備與測定 按處方比例及工藝自制不含水飛薊賓的空白樣品，按供試品溶液的制備方法制備，測定，結(jié)果表明處方中其它藥材不干擾水飛薊賓的測定，見圖3C。

圖2 新安軟膠囊中不飽和脂肪酸GC圖Fig.2 GC chromatogram of unsaturated fatty acid in Xin'an Soft Capsules

圖3 水飛薊賓對照品 (A)、供試品 (B)及陰性對照樣品 (C)HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of silybin reference substance(A)，Xin'an Soft Capsules sample(B)and negative sample(C)

2.2.4 標準曲線及線性范圍 精密稱取水飛薊賓對照品8.22 mg，加甲醇溶解，并定容于10 mL量瓶中。分別精密量取對照品溶液 0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取5 μL，按上述色譜條件測定峰面積。以峰面積積分值Y為縱坐標，水飛薊賓溶液質(zhì)量濃度X(mg/mL)為橫坐標，得線性方程為:Y=11 264 551X-122 560，相關(guān)系數(shù)r為0.999 2，表明水飛薊賓在0.016 4～0.822 0 mg/mL范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

2.2.5 精密度實驗 取同一批號 (20091209)新安軟膠囊10粒 (稱樣質(zhì)量0.241 39 g)，按2.2.2項供試品溶液的制備方法操作，按上述色譜條件進行測定。重復進樣6次，峰面積積分值的RSD值為0.31%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.2.6 重復性實驗 取同一批號 (20091209)新安軟膠囊內(nèi)容物6份，按2.2.2項供試品溶液制備法操作，按上述色譜條件進行測定，水飛薊賓平均質(zhì)量分數(shù)為4.58%，RSD值為0.69%。

2.2.7 穩(wěn)定性實驗 取同一批號 (20091209)新安軟膠囊10粒 (稱樣質(zhì)量0.241 39 g)，按2.2.2項供試品溶液的制備方法操作，按上述色譜條件進行測定。按0、0.5、1、2、4、8、12、24 h時間點進樣，水飛薊賓峰面積值在24 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD值為0.66%。結(jié)果表明該法穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率實驗 采用加樣回收法，取已知含有量的新安軟膠囊 (批號20091209，質(zhì)量分數(shù)為4.58%)，分別添加水飛薊賓對照品，按2.2.2項供試品溶液制備法操作，按上述色譜條件進行測定，結(jié)果平均加樣回收率為99.06%及其RSD值為0.57%。本法具有良好的回收率。

2.2.9 3批新安軟膠囊樣品測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5 μL，按上述色譜條件測定，樣品測定結(jié)果見表2。

表2 3批新安軟膠囊樣品中水飛薊賓測定結(jié)果Tab.2 Determination results of silybin in three batches of Xin'an Soft Capsules samples

2.3 薄層鑒別［9］稱取本品內(nèi)容物1.0 g，置于25 mL量瓶中加甲醇適量，超聲使分散溶解，并用甲醇定容至刻度，靜置，取上清液作為供試品溶液;依法制備缺水飛薊賓空白樣品溶液;另取水飛薊賓對照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法 (附錄ⅥB)實驗，吸取上述供試品溶液與對照品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸 (8∶6∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，見圖4。

圖4 3批新安軟膠囊樣品TLC鑒別圖Fig.4 TLC identification picture of three batches of Xin'an Soft Capsules samples

3 討論

3.1 GC檢測方法的改進 對文獻［3］的方法進行了改進，即升高氫焰離子化檢測器的溫度、增大載氣流量、增加燃氣與助燃氣的流量，使分析檢測時間縮短了30min，節(jié)約了分析成本。因此，可以用作本品定量檢測指標。

3.2 水飛薊賓的測定 參考文獻［9］，使用流動相甲醇-水-冰醋酸 (48∶52∶1與50∶50∶0.5)時，水飛薊賓及其對映體分離度小，且理論塔板數(shù)小于5 000;使用流動相甲醇-1%冰醋酸 (50∶50)時，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于5 000，且陰性無干擾。因此，可以用作本品定量檢測指標。

3.3 水飛薊賓的TLC鑒別 參考文獻［10］，對新安軟膠囊中水飛薊賓的定性鑒別，使用甲苯-甲酸乙酯-甲酸(10∶6∶1)為展開劑，展開一次，結(jié)果Rf值小于0.3;使用甲苯-甲酸乙酯-甲酸 (8∶6∶1)時，Rf值大于0.5，供試品色譜中在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同的顏色斑點，在與陰性對照相應(yīng)位置上無斑點，專屬性強，可以作為本品定性檢測指標。

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