指紋圖譜結合響應面法研究醋制南五味子炮制工藝

鄧 翀， 鄭 潔， 宋小妹

(陜西中醫學院藥學院，陜西咸陽712046)

南五味子又稱華中五味子，為木蘭科植物華中五味子Schisandra sphenantheraRehd.et Wils.的干燥成熟果實，具有益氣、斂肺、生津、止渴、止瀉、斂汗、壯陽、補腎等功能，是產自我國的名貴中藥材［1］。2010年版中國藥典一部［2］規定的醋蒸南五味子的炮制沒有量化標準，文獻報道主要以多糖、總木脂素為評價標準［3-8］，無法體現醋制對南五味子化學成分的整體影響。基于此，本實驗擬以指紋圖譜為評價指標，采用Box-Benhnken實驗設計的響應面分析法和多元二次回歸方程擬合因素與指標之間的函數關系，優化南五味子醋制工藝參數，旨在為南五味子的臨床炮制用藥提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器 高效色譜儀 (L-2130二元泵，L-2400檢測器，日本日立公司);GB2042電子天平 (瑞典薩多利斯)。

1.2 試劑 南五味子藥材 (采購于陜西省南鄭縣，經陜西中醫學院生藥教研室王繼濤高級實驗師鑒定為南五味子Schisamdra sphenantheraRehd.et Wils.);乙腈為色譜純，水為重蒸餾水;其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 溶液的制備 精密稱取南五味子炮制樣品粉末 (60目篩)約1 g，用55%乙醇，溶媒用量為16倍，提取時間為60 min，提取次數為2次，濾過，提取液在80℃水浴濃縮，揮干溶媒，以55%溶解，定容于25 mL量瓶中［9］。儲存于4℃，冷藏待用。

2.2 炮制樣品指紋圖譜方法建立

2.2.1 色譜條件 依利特ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱;流動相為乙腈 (A)-水(0.2%磷酸)梯度洗脫 (0～10 min，5% ～30%A;10～20 min，30% ～42%A;20～30 min，42% ～52%A;30～50 min，52% ～48%A;50～60 min，48% ～48%A;60～70 min，48% ～55%A;70～80 min，55% ～70%A;80～85 min，70% ～85%A;85～90 min，85% ～95%A;90～100 min，95% ～100%A;100～110 min，100% ～100%A);體積流量0.8mL/min;檢測波長230 nm;進樣量10 μL。色譜圖見圖1。經對照品鑒定，10號峰為五味子甲素。本實驗主要以指紋圖譜共有色譜峰峰面積綜合評分為評價指標，故未列出對照品相關色譜圖。

圖1 南五味子指紋圖譜共有色譜峰Fig.1 HPLC chromatogram of Schisandra sphenanthera

2.2.2 精密度試驗 以2.2.1項色譜條件下，取編號為1的供試品溶液10 μL，重復分析5次，記錄指紋圖譜。共有色譜峰數據顯示，各峰相對保留時間的RSD不大于0.2%，各峰相對峰面積的RSD不大于2.0%。

2.2.3 穩定性試驗 以2.2.1項色譜條件下，分別取編號為1的供試品溶液10 μL，于0、4、8、12、16、24 h進樣采集色譜圖數據。共有色譜峰數據顯示，各峰相對保留時間的RSD不大于0.4%，相對峰面積的RSD不大于5%，說明供試樣品溶液在24 h內穩定。

2.2.4 重復性試驗 精密稱取編號為1的南五味子炮制樣品粉末5份，每份1.0 g，按2.1項下條件制備供試品溶液，在2.2.1項色譜條件下進行HPLC分析，記錄指紋圖譜數據。共有色譜峰數據顯示，各峰相對保留時間的RSD不大于0.2%，相對峰面積的RSD不大于5.0%。

2.3 炮制工藝研究方案 根據文獻資料 ［3-8］，選擇南五味子醋制炮制工藝考察因素為加醋量、悶潤時間、蒸制時間。采用Design Expert 8.05軟件Box-Behnken試驗設計的3因素3水平設計方法設計實驗方案。試驗因素水平設計見表1，共設計17組炮制實驗點。

表1 Box-Behnken試驗設計考察因素與水平編碼Tab.1 Factors and levels Box-Behnken RSM test

2.4 數據處理方法 采用信息量權重法對數據進行處理，采用均值標準差法對數值進行標準化，根據各評價指標包含的信息量來確定權重，采用變異系數法，變異系數越大，該化學成分所賦的權重越大［10-14］。

圖2 悶潤時間和加醋量對綜合評分影響的三維曲面和等高線Fig.2 Response surface plots and contour plots of multual-influence of the amount of vinegar and moistening time on comprehensive score

以Xij表示第i次實驗中第j個指標的測定值，i=1，2，…，n;j=1，2，…，k。首先以各指標的最大值 (即各色譜圖中同一相對保留時間的各色譜峰中峰面積值最大者)作為參照，對同一指標各數據進行標準化處理，Dij表示第j個指標下的第i個測定值的標準化數據。

按各指標變異系數確定加權系數。以RSDj表示第j個指標的變異系數;根據各色譜峰的重要程度賦權值為Ej，由于無法確定各組分的貢獻大小，故認為指紋圖譜中的各個色譜峰所代表的各組分貢獻值相同，均設為1。主要以各組數據的相對標準差確定其權重系數:

因此，多指標實驗公式為:

(3)式計算所得的兼顧各指標綜合效應的公式，得分越大越好。

3 結果

3.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗

3.1.1 醋制工藝綜合評分回歸模型的建立 Box-Behnken實驗設計方案和各指紋圖譜的共有色譜峰的綜合評分數據見表2。

將表2中各組綜合評分數據采用Design Expert 8.05軟件進行多元回歸和二項式分析，建立南五味子醋制工藝綜合評分 (Y)對3個因素 (X1、X2、X3)的二次回歸模型方程為:Y=55.53+3.95×X1-0.14×X2-0.48×X3-0.059×X1×X2+0.48×X1×X3+1.87×X2×X3-2.42×X21-2.94×X22-1.77×X23。不同考察因素與綜合評分的響應面分析見圖2～圖4的三維曲線及等高線。

表2 響應面分析試驗結果Tab.2 Design and results for response surface analysis

3.1.2 方程的顯著性檢驗 對綜合評分 (Y)與3個因素的回歸模型進行方差分析，結果見表3。方差分析顯示，模型的F=11.70(P=0.001 9，小于0.01)，表明實驗結果誤差較小，模型的失擬項F=1.26(P=0.402，大于0.05)，表明失擬項誤差對模型沒有顯著性影響，模型擬合合理。方差分析結果顯著分別是一次項X1，交互項X2X3，二次項X21、X22、X23，表明各考察因素對綜合評分的影響不僅是線性關系，還存在交互綜合影響。模型的相關系數平方為0.937 7，表明該模型比較準確地反映醋制南五味子化學成分譜綜合評分與加醋量、悶潤時間、蒸制時間的關系，可以用該回歸方程對醋制南五味子炮制工藝進行分析與預測。

圖3 醋蒸時間和加醋量對綜合評分影響的三維曲面和等高線Fig.3 Response surface plots and contour plots of multual-influence of the amount of vinegar and steaming time on comprehensive score

圖4 醋蒸時間和悶潤時間對綜合評分影響的三維曲面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour plots of multual-influence ofsteaming time and moistening time on comprehensive score

表3 回歸模型方差分析Tab.3 Variance analysis for the regression model established

3.2 最佳工藝條件預測與試驗驗證 通過回歸模型的預測，得到南五味子醋制最佳工藝條件為每100 g藥材加醋量為28.10 g，悶潤時間1.95 h，蒸制時間3.90 h。考慮到工業化生產的實際操作，將提取工藝參數修正為每100 g藥材加醋量為30 g，悶潤時間2 h，蒸制時間4 h。為檢驗實驗結果的可靠性，采用上述工藝參數進行南五味子炮制工藝試驗進行3次平行試驗，在上述工藝參數下炮制南五味子綜合評分值與理論預測值吻合程度良好。

4 討論

4.1 文獻報道南五味子醋制炮制工藝多以多糖、總木脂素為評價標準進行研究［3-8］，本實驗以指紋圖譜共有色譜峰峰面積綜合評分為評價指標，從化學成分譜角度對南五味子醋制工藝進行研究，共有色譜峰峰面積綜合評分沒有預先設定指標，主要反映炮制因素影響下化學成分群在炮制過程的整體變化情況，可以從整體角度反映炮制因素差異導致化學組分變化，突破以單一化學部位或單一成分為評價指標的片面性。采用Box-Behnken響應面設計優選醋制五味子的炮制工藝，經Design Expert 8.05軟件分析實驗數據，篩選出的炮制工藝為每100 g藥材加醋量為28.10 g，悶潤時間1.95 h，蒸制時間3.90 h，考慮到工業化生產的實際操作將醋制南五味子炮制工藝修正為每100 g藥材加醋量為30 g，悶潤時間2 h，蒸制時間4 h。

4.2 目前關于南五味子的炮制工藝研究報道主要通過正交實驗設計［3-8］，它不能在給出的整個區域上找到因素和響應值之間的一個明確的函數表達式即回歸方程，從而無法找到整個區域上因素的最佳組合和響應值的最優值［15］。而響應面法是通過一系列確定性的試驗擬合一個響應面來模擬真實極限狀態曲面。將多因子實驗中，因子與實驗結果的相互關系，用多項式近似，把因子與實驗結果 (響應值)的關系函數化，依此可進行函數的面分析，研究因子與響應值之間，因子與因子之間的相互關系，并進行優化，從而找到整個區域上因素的最佳組合和響應值的最優值，最終篩選和預測最佳的工藝參數，在實驗設計中更科學、更準確。

［1］魏景文.五味子藥理研究新進展［J］.天津藥學，2009，21(5):55-57.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京，中國醫藥科技出版社，2010:298.

［3］李 莉，陸兔林，黃 瑋，等.高壓醋蒸五味子炮制工藝研究［J］.南京中醫藥大學學報，2009，25(2):110-113.

［4］宋小妹，崔九成，孫寶平，等.醋南五味子炮制工藝研究［J］.陜西中醫學院學報，2009，32(3):65-66.

［5］殷放宙，陸兔林，蔡寶昌.炮制對五味子中木脂素的影響［J］.中草藥，2009，37(9):1341-1344.

［6］孫華芳，李 潔.正交實驗法優選南五味子的炮制工藝［J］.西北藥學雜志，2009，24(5):369-370.

［7］孫 靜，吳 瑛.醋蒸南五味子炮制工藝的研究［J］.貴陽中醫學院學報，2011，33(2):26-28.

［8］蒲宇紅，王曉義，李國昌.正交設計優選醋制五味子的炮制工藝［J］.中國藥師，2007，10(2):186-187.

［9］鄧 翀，顏永剛，梁 婷，等.多指標綜合評價南五味子木脂素提取工藝［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17(9):4-6.

［10］王 暉，陳 麗，陳 墾，等.多指標綜合評價方法及權重系數的選擇［J］.廣東藥學院學報，2007，23(5):583-589.

［11］于魯海，李燕菊，孫 力，等.利用活性部位指紋圖譜篩選驅蟲斑鳩菊提取工藝［J］.中藥材，2007，30(12):1589-1591.

［12］劉雅敏，郭丹丹，楊 晉，等.指紋圖譜法優選訶子提取工藝的研究［J］.中成藥，2011，33(7):1168-1171.

［13］于魯海，徐建國，李燕菊，等.指紋圖譜在驅蟲斑鳩菊澄清工藝中的應用［J］.中國民族醫藥雜志，2007，(7):57-59.

［14］鄧 翀，顏永剛，姚天鵝.正交實驗結合指紋圖譜篩選白鮮皮提取工藝［J］.云南中醫學院學報，2011，34(4):25-34.

［15］周桂芬，呂圭源，陳素紅.響應面分析法優化加速溶劑萃取當歸中阿魏酸的工藝參數［J］.中成藥，2010，32(5):775-778.