巴豆中佛波醇酯類成分及其生物活性研究進展

王 磊， 劉 振， 高文遠， 張靜澤

(1.天津大學藥物科學與技術學院，天津 300072;2.天津中新藥業集團股份有限公司樂仁堂制藥廠，天津 300380)

巴豆Croton tigliumL.為大戟科Euphorbiaceae巴豆屬植物，又名巴菽、剛子、江子、老陽子、雙眼龍、猛子仁等。巴豆種子供藥用，種子的油即巴豆油，有大毒，作峻瀉劑;其根、葉也可入藥，治療風濕骨痛等;民間亦用其枝、葉作殺蟲藥或毒魚［1］。

對于巴豆的化學成分研究，國內外學者更多的側重于巴豆種子的研究，巴豆油是巴豆種子中的主要成分和藥效活性成分，亦為毒性成分，刺激皮膚，其主要的化學成分是佛波醇二萜酯類化合物［2-4］，是一個具有四環巴豆烷母核的二萜酯類化合物。

1 佛波醇酯分離方法

佛波醇酯類化合物不穩定，對熱、光、氧氣、酸和堿較敏感，在分離過程中容易發生氧化、酯化和差向異構化［5］，因此，需要在無氧環境下分離，萃取時采用氮氣或者氬氣保護，常用的分離方法是將巴豆用甲醇提取后，除去溶劑后，殘余物溶于甲醇-水 (一般比例為9∶1)混合溶液中，用己烷分配除去長鏈脂肪酸，然后用乙醚萃取，得到富含二萜類化合物的乙醚提取物。經硅膠和硅酸鎂吸附柱層析分為幾個部位，再采用液滴逆流色譜和薄層制備的方法進一步分離［6］，或者采用液滴逆流色譜和低壓柱層析方法聯用［7］;由于液滴逆流色譜的復雜性以及不廣泛性，隨后，Ocken［8］采用干柱色譜的方法從巴豆油中分離出佛波醇酯類化合物;隨著制備液相的出現，Mekkawy［9］等采用中壓色譜柱的方法分離得到佛波醇酯類化合物。

2 佛波醇酯結構

1941年，Berenblum［10］從巴豆油中發現佛波醇酯化合物，1967年Hecker［11］確定該類化合物結構，由于巴豆油中的該類成分極性較小，其分離獲得比較困難，早期，Marshall［7］液滴逆流色譜方法對其進行分離，巴豆油經環己烷提取后，用甲醇-水 (20∶3)萃取后采用DCCC(環己烷-二乙醚-異丙醇-乙醇-水作為上相流動相)進行洗脫，然后再采用不同流動相的DCCC方法進行分離，以及采用制備薄層色譜的方法獲得不同的佛波醇酯化合物;日本學者Mekkawy［9］采用中壓色譜柱的方法對其進行分離，巴豆采用甲醇提取后，采用極性小的環己烷或者乙醚萃取后，經環己烷-乙酸乙酯硅膠柱洗脫后，得到粗的成分，再采用RP-18硅膠柱 (甲醇-乙腈，1∶1)分離后，用中壓色譜柱(RP-18，RP-2，Si60)采用不同的洗脫系統 (甲醇-水;環己烷-乙醚-乙酸乙酯)進行分離。現已從巴豆中分離出33種佛波醇酯化合物［12］(化合物1～33，見圖1，表1)，并采用LC-MS-MS，通過三步法確定該化合物的特征碎片離子，根據分子量快速簡便鑒定化合物［13］。

圖1 佛波醇酯化合物化學結構母核

3 佛波醇酯衍生物

El-Mekkawy［9，14］通過比較巴豆油中的 8 個佛波醇酯化合物抗HIV-1活性，合成了成了44個佛波醇酯衍生物 (化合物34～74，化合物86～88);化合物12抑制HIV-1的活性很強，但是該化合物在血漿中不穩定，為了得到活性強且在血漿中穩定的化合物，以該化合物為基礎合成了C-13位不變，C-12位為醚鍵的5個衍生物［15］(化合物75～79)。同時根據化合物24具有抗HIV-1活性而無腫瘤促進作用［16］，合成了6個巴豆醇-13-單酯化合物［17］(化合物80～85)。上述55種衍生物是改變取代基的酯鏈長度，并未引入極性大的官能團，極性的變化并不大，Bertolini［18］等又合成了21種C-12，C-13為極性官能團 (如酰胺、羧酸、銨鹽)的佛波酯類似物。

表1 佛波醇酯化合物結構

圖2 佛波醇酯衍生物化學結構母核

對佛波醇酯的結構改造，多數是在保持母核不變而只改變側鏈的取代基發現活性強的化合物，Wender［19］等則通過改變母核結構合成了4種 (化合物89～92)佛波醇酯衍生物。而Yamatsugu［20］根據佛波醇酯化合物結合蛋白激酶C(PKC)的能力，合成了9種佛波醇酯類衍生物(化合物93～101)，從中尋找特異性抑制PKCα受體的化合物。佛波醇酯特殊的五元環結構除了能夠激動或抑制蛋白激酶C外，還能和其它受體結合，從而產生不同的生物活性，如4α-佛波醇酯化合物對蛋白激酶C無活性，但是它可以激活瞬時感受器香草素電位離子通道 (TRPV4)，據此合成了多種佛波醇酯衍生物［21］。

表2 佛波醇酯衍生物化學結構

續表2

4 佛波醇酯化合物的生物活性

佛波醇酯類化合物具有多效生物活性，研究最多的是其與蛋白激酶C結合產生的作用，毒性方面如促腫瘤形成、炎癥、細胞增殖、血小板聚集等作用，但同時也有抗HIV-1引起的細胞病變、抗紅白血細胞等作用。

4.1 調節蛋白激酶C 佛波醇酯化合物與二酰甘油(DAG)相似，為蛋白激酶C激動劑，均調節依賴Ca2+(α，βⅠ，βⅡ，γ)和非依賴Ca2+(δ，ε，η，θ，μ)的蛋白激酶C同工酶［22-23］，并且作用機制相似，都結合到蛋白激酶C的C1領域，但佛波醇酯與蛋白激酶C是不可逆結合［24］，如化合物2能夠激活蛋白激酶C產生毒副反應，如誘發腫瘤、刺激皮膚等，而有些如化合物12卻能夠抑制腫瘤的生長，說明佛波醇酯的結構影響其作用。采用合成的方法探討其關系，通過改變母核結構合成不同的佛波醇酯衍生物，化合物91和92與蛋白激酶C的親和力強，說明C-2的剛性結構起著重要的作用［19］;C-3，4，9，20位的羥基自由基與蛋白激酶C的親和力密切相關;C-12，13位取代基的疏水性/親水性影響蛋白激酶C的活性［25］，其中C-12位酯鏈是決定化合物是否為蛋白激酶C激動劑/抑制劑的基本因素［26］，由此合成了一系列的化合物，當C-12，C-13為極性官能團 (如酰胺、羧酸、銨鹽)時，能夠使得蛋白激酶C的遷移能力降低，即促癌活性降低，這兩位為短的羧酸鏈就可以使蛋白激酶C的活性降低90%，最有可能成為蛋白激酶C抑制劑的化合物為C-12，13位為羧酸的佛波酯類似物［18］。但是在合成過程中又發現了一種新的作用機制，當C-12位存在缺電子的芳香基團時，能顯著提高化合物與蛋白激酶C的親和力［20］，說明這兩者的親和力不僅與母核上的羥基自由基有關，還與C-12位的取代基的電子云有關。蛋白激酶C有多種亞型結構，得到其某一亞型的專一性激動劑或抑制劑是發現新藥的關鍵點，從中尋找特異性抑制PKCα受體的化合物時，發現化合物97、98的活性強，判斷出缺電子的芳香環和聚醚側鏈均為抑制蛋白激酶 C 的重要基團［20］。

圖5 佛波醇酯骨架結構與蛋白激酶C活性的關系

4.2 抗HIV-1作用 從巴豆油中分離出的化合物2、12、25和33能夠完全抑制HIV-1誘導的MT-4細胞病變作用(IC100分別為 7.6 ng/mL、7.81 μg/mL 和 0.48 ng/mL)［9］;從Homalanthus nutans中分離出的Prostratin(化合物24)具有強的抗 HIV-1活性［16］;以及從Euphorbia poissonii和Euphorbia resiniferaBerg中分離出的脫氧佛波醇酯類化合物也具有強的抗HIV-1作用［27］，雖然都是佛波醇酯類化合物并且均可以抑制HIV-1引起的細胞病變，但是產生的細胞作用不同，通過合成不同的佛波醇酯衍生物發現化合物的構型明顯地影響其活性［14-15，17］，如 C-4位為 α-OH或被甲氧基取代則失活;C-20位被乙酸取代后，活性明顯下降;C-3位羰基改為羥基后，活性降低;增加或減少脂肪酸碳鏈的數目都能明顯降低活性。如今利用合成的方法得到的抗HIV-1活性強、毒性小的為化合物75和化合物84，并且化合物84的活性強于化合物24 10倍［15，17］。

4.3 毒副作用 巴豆油有一定的毒副作用，主要包括刺激性、致癌性、抑制蛋白質合成和遺傳損傷作用。對于巴豆引起的致癌作用報道的也較多，如小鼠口服巴豆油可引起胃部乳頭狀瘤及癌;大鼠腹腔注射巴豆油，可降低肝癌抑制因子水平;與其他致癌物合用時，致癌率也明顯提高。

4.3.1 炎癥作用 巴豆油具有強的皮膚刺激作用，外用對皮膚、黏膜有強烈的刺激性，引起發紅，口服半滴至1滴即能產生口腔及胃黏膜的燒灼感及嘔吐，并產生嚴重腹瀉，甚至消化道出血、腎臟損傷、血尿、血閉等。灌胃給予小鼠兩周后，電子顯微鏡下可見空腸、結腸黏膜上皮細胞腫脹，及炎癥反應;巴豆油酸可引起腹痛、腹瀉等消化道炎癥，甚至引起腸壞疽;巴豆毒素作為一種劇烈的原形毒物，可引起皮膚、黏膜發赤、氣泡等炎癥。化合物2是最強的刺激劑 (作用機制見圖6)［28］。佛波醇酯的結構影響其活性，化合物33不能引起炎癥，而能引起細胞增生［29］;12-脫氧巴豆醇酯類化合物有炎癥作用［30］。研究發現側鏈取代基不同時，刺激能力、炎癥達峰時間和持續時間亦不同，一般單酯比二酯的刺激能力強，持續時間長，而炎癥的持續時間與母體結構中自由羥基的個數相關，但是4位的構型 (α與β)與炎癥持續時間無關［31］，并且抗組胺藥或前列腺素合成酶抑制劑對巴豆油引起的皮膚炎癥不起作用，而皮質醇或相關的皮質甾醇類藥物能夠抑制該作用［32］。

圖6 佛波醇酯引起的炎癥反應

4.3.2 促腫瘤形成 1941年，Berenblum［10］從巴豆油中發現佛波醇酯類化合物，將其涂抹到小鼠皮膚時發現它能加速腫瘤的形成;1947年，Berenblum和Shubik［33］發現它的促癌活性僅是在用了致癌劑后才具有，本身不具有致癌作用，1979 年，Matsukura［34］等人將巴豆油和N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍用于小鼠實驗中，發現這兩者單獨應用時，沒有產生胃癌，但是同時應用時，在小鼠中出現了胃癌細胞，進一步證實了巴豆油的促癌而非致癌作用。Hecker［6］從巴豆油中分離出了12，13-佛波醇酯類化合物，并確定其為潛在的促癌活性成分，其中化合物2是最強的促癌劑。對其機制進行研究后，該類化合物能夠促進腫瘤形成，是由于其能夠激活蛋白激酶C［35］，從而調節信號通道引起基因轉錄，導致細胞增生。巴豆毒素通過抑制蛋白質合成、溶解紅細胞，使局部組織發生變性、壞死，可導致死亡［12］。

而有些佛波醇酯化合物卻能夠導致腫瘤細胞的凋零死亡。在一些惡性腫瘤細胞中，佛波醇酯化合物激活蛋白激酶C后，會發現一些細胞會停止生長或者凋零死亡，有多種因素影響這一活性的改變，如蛋白激酶C激活的多種代謝途徑、蛋白激酶C的磷酸化作用、蛋白激酶C的細胞定位、蛋白激酶C與其它信號分子的相互作用以及蛋白激酶C與不同底物的結合［36-37］，但是化合物12能夠抑制細胞的病變且不激活蛋白激酶C［14］，說明化合物的結構亦影響其活性。

4.4 其它作用 佛波醇酯還能引起血小板的聚集、細胞增殖以及抗白血病等作用，如化合物2能夠引起人紅白血細胞中巨核細胞的病變，前列環素能夠抑制該作用，前列腺素對其無影響，推斷該作用可能通過環單磷酸腺苷［38］;化合物8可以對抗P388淋巴細胞癌及抗白血病的活性［34］。

動物實驗以及人體試驗發現，佛波醇酯化合物對不同組織和動物種類有不同的作用，呈現雙向調節，如既能激動蛋白激酶C亦能抑制蛋白激酶C，同樣對平滑肌作用時也會出現收縮和松弛雙向作用，如化合物14和化合物17對人支氣管的作用是先松弛后收縮，最初的松弛作用是激活了Na+/K+-ATPase，而隨后的收縮作用則依賴于細胞外Ca2+進入［39］。研究富含該類化合物的巴豆油時，也發現這種雙向調節作用［40］，如采用兔離體空腸平滑肌模型，研究巴豆油對其的收縮作用，表明該作用與濃度有關，濃度低時收縮;濃度高時則無收縮作用，作用機制是通過M3毒蕈堿受體和 L-型 Ca2+通道［41］介導。

5 結語

雖然巴豆有毒副作用，但是已有兩千年的藥用歷史特別適用于胃腸道疾病，如腸梗阻、腹瀉、腸炎、菌痢等，能夠治療頑固性便秘，臨床應用廣泛，巴豆油富含的佛波醇酯化合物，既是毒性分成也為活性成分，現代藥理研究表明，該類化合物具有多種生物活性，但是對巴豆本身的瀉下作用機制研究較少，研究最多的是其與蛋白激酶的關系。雖然從巴豆發現的該化合物數目有限，但是以其特殊的四元環母核合成一系列衍生物是發現活性好、毒性小化合物的主要方法，也表明研究該化合物具有較好的應用開發潛力。

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