苦參及山豆根主要生物堿鎮痛抗炎作用研究

錢利武， 戴五好， 周國勤， 王麗麗， 汪海孫*

(1.安徽省藥物研究所，安徽合肥 230022;2.安徽省中藥研究與開發重點實驗室，安徽合肥 230022;3.安徽中醫學院，安徽合肥 230031;4.安徽醫學高等專科學校，安徽合肥 230601)

苦參為豆科槐屬植物苦參Sophora flavescensAit.的干燥根，具有清熱燥濕、殺蟲止癢、通利小便和抗炎抗腫瘤等功效。山豆根系豆科槐屬植物越南槐Sophora tonkinensisGapnep.的干燥根及根莖，功效為清熱解毒、消腫利咽［1］。苦參及山豆根均為我國常用中藥，現代植物化學研究顯示苦參、山豆根的主要藥效活性成分為生物堿類化合物，其中苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐定堿屬于苦參堿型生物堿，是由三價氮原子形成稠合的兩個哌啶環 (又稱雙稠哌啶)組合而成，不同分子之間的差別表現在H的構型以及雙鍵的有無。野靛堿、N-甲基金雀花堿和鷹爪豆堿分別屬于金雀花堿型和鷹爪豆堿型，與苦參堿型化合物結構相似，野靛堿與N-甲基金雀花堿的區別在于氮原子上有一個甲基取代，具體化學結構見圖1。

藥理學研究表明，苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿及氧化槐定堿等具有顯著的抗炎、鎮痛及抗腫瘤等活性，同時也存在不容忽視的毒性作用［2-7］，然而，前人的文獻多以單個苦參堿類化合物為對象，未能系統的反映苦參堿類化合物抗炎、鎮痛活性與化合物結構之間的相關性。本研究以中藥苦參及山豆根中主要的生物堿:苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、槐定堿、氧化槐果堿、野靛堿、N-甲基金雀花堿及鷹爪豆堿為研究對象，通過建立醋酸扭體疼痛模型和小鼠耳腫脹及腹腔毛細血管通透性等不同炎癥模型來研究和探討這幾種生物堿的鎮痛抗炎活性，以期揭示出苦參及山豆根中主要生物堿的鎮痛抗炎活性及其構效關系，為苦參堿類生物堿的鎮痛抗炎藥物的開發和應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 受試藥物 苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐定堿、鷹爪豆堿、N-甲基金雀花堿、野靛堿 (購自南京澤朗醫藥科技有限公司，純度均在98%以上);吲哚美辛腸溶片，上海信誼黃河制藥有限公司 (國藥準字:H31020148，產品批號100401);醋酸地塞米松片，上海信誼藥廠有限公司 (國藥準字 H31020793，產品批號100702)。

圖1 苦參、山豆根中生物堿的主要代表化合物

1.2 試劑 冰醋酸，上海申博化工有限公司產品，分析純(批號0501101);二甲苯，西隴化工股份有限公司，分析純 (批號1007032);伊文思藍，生工生物工程 (上海)有限公司 (CAS登記號:314-13-6，批號 ZL0706B10011Z);氯化鈉注射液，安徽豐源藥業股份有限公司 (國藥準字H34021874，批號110504K1)。

1.3 動物 昆明種小鼠，雄性體質量 (20±2)g，由安徽醫科大學動物實驗中心提供。

1.4儀器 TU—1810紫外可見分光光度計，北京譜析通用儀器有限責任公司;AEY—210型電子分析天平，湘儀天平儀器設備有限公司產品 (編號:91088);1 mL一次性無菌注射器，河南曙光健士醫療器械集團有限公司;打耳器等。

2 方法

2.1 冰醋酸致小鼠扭體的影響 取雄性昆明種小鼠，(20±2)g，隨機將小鼠分成若干組，每組8只。分別為生理鹽水模型組、地塞米松陽性對照組 (2.5 mg/kg)、各化合物分小、中、大劑量組，尾靜脈給予受試化合物、地塞米松和生理鹽水，于末次給藥30 min后腹腔注射0.8%冰醋酸0.1 mL/10 g，觀察記錄小鼠20 min內扭體反應次數 (表現腹部內凹，軀干與后肢伸張，臀部高起)，并計算抑制率［8］。

鎮痛抑制率 (%)=(生理鹽水組平均扭體次數-給藥組平均扭體次數)/生理鹽水組平均扭體次數×100%。

2.2 二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響 選取雄性昆明小鼠(20±2)g，隨機將小鼠分成若干組，每組8只，分別為生理鹽水模型組，吲哚美辛陽性對照組 (20 mg/kg)，各化合物分小、中、大劑量組，吲哚美辛組分別灌胃給予0.2 mL/10 g相應供試液，第1天上、下午各一次，第2天給藥后0.5 h做試驗。尾靜脈給予各化合物和生理鹽水，于末次給藥后30 min于小鼠右耳涂抹二甲苯20 μL，20 min后脫頸椎處死，剪取左右耳，用直徑為8 mm的打孔器沿左右耳片同一部位打下圓耳片，在電子天平上稱質量，右耳與左耳質量之差即為腫脹度。并計算腫脹抑制率［9］。

腫脹抑制率 (%)=(生理鹽水組平均兩耳質量差-給藥組平均兩耳質量差)/生理鹽水組平均兩耳質量差×100%。

2.3 對小鼠腹腔毛細血管通透性的影響 選取雄性昆明小鼠 (20±2)g，隨機將小鼠分若干組，每組8只，分別為生理鹽水組，吲哚美辛組 (20 mg/kg)，各化合物分小、中、大劑量組，和生理鹽水組，吲哚美辛組分別灌胃給予0.2 mL/10 g相應供試液，第1天上、下午各1次，第2天給藥后0.5 h做試驗。尾靜脈給予各化合物和生理鹽水，末次靜脈注射給藥40 min后各小鼠尾靜脈注射0.5%依文思藍溶液0.1 mL/10 g，隨即腹腔注射0.8%的冰醋酸溶液0.1 mL/10 g，20 min后脫頸處死，暴露腹腔，用6 mL生理鹽水分3次洗滌腹腔，吸管吸出洗滌液，合并后加生理鹽水至10 mL 3 000 r/min離心15 min，取上清液于590 nm處測吸光度，并以對照組小鼠染料的滲出量為100%計算給藥組小鼠滲出量的抑制率［10］。

抑制率=(生理鹽水組滲出量-給藥組滲出量)/對照組滲出量×100%

3 結果

3.1 對冰醋酸所致小鼠扭體反應的影響 結果顯示高劑量40 mg/kg苦參堿、槐定堿能夠顯著抑制醋酸刺激腹腔黏膜引起的疼痛反應，顯著減少扭體次數。40 mg/kg劑量時苦參堿、槐定堿能夠有效抑制醋酸刺激腹腔黏膜引起的疼痛反應，減少扭體次數。由于槐定堿在40 mg/kg劑量時引起部分實驗動物死亡，因而將最大安全劑量調整為30 mg/kg，實驗動物均未出現死亡現象。其他結果見表1。

表1 苦參類生物堿對醋酸致小鼠扭體反應的影響

3.2 對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響 小鼠右耳涂二甲苯后，耳廓顯著腫大，腫脹度高達16.5 mg，山豆根、苦參藥材中大部分生物堿顯著抑制二甲苯所導致小鼠耳廓腫脹的急性炎癥反應，表現為腫脹度降低，其中氧化苦參堿、槐果堿高劑量組對二甲苯所導致的急性炎癥反應具有顯著的抑制作用，抑制率分別為70.72%和70.42%，金雀花型生物堿活性明顯低于其它類型的生物堿，實驗結果見表2。

3.3 對小鼠腹腔毛細血管通透性的影響 表3實驗結果提示，山豆根、苦參藥材中大部分單體生物堿具有顯著的抑制炎癥滲出，降低小鼠腹腔毛細血管通透性的作用。其中苦參堿、槐果堿、槐定堿降低小鼠腹腔毛細血管通透性的活性相對較強。

4 討論

生物堿類化合物為中藥苦參及山豆根的主要活性成分［11-12］，一直備受研究者的關注，已有文獻通過灌胃、腹腔注射及肌肉注射等方式給藥，通過尾靜脈給藥的鮮有報道。本實驗鎮痛實驗結果顯示，苦參堿、槐果堿與其氧化產物氧化苦參堿和氧化槐果堿相比活性相對較強，N氧化物導致其鎮痛活性的降低;苦參堿、槐定堿、槐果堿三者結構較為接近，差別在于H的空間構型和D環上雙鍵的有無，但在鎮痛活性方面差異明顯，苦參堿、槐定堿鎮痛方面活性相對較強，從結構上看可能與化合物D環上的雙鍵有關;而苦參堿與槐定堿的活性接近，說明A環上H構型對鎮痛活性的影響較小。鷹爪豆堿、N-甲基金雀花堿、野靛堿屬于金雀花堿型和鷹爪豆堿型，鎮痛活性不明顯。

表2 苦參類生物堿對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹度的影響

表3 苦參類生物堿對小鼠皮膚毛細血管通透性的影響

在二甲苯所致耳廓腫脹實驗中，氧化苦參堿、槐果堿的抗炎活性明顯強于別的受試化合物，尾靜脈注射劑量為40 mg/kg時，腫脹抑制率分別為70.719 7% ±0.273 8%和70.424 2%±0.433 6%，而槐定堿及其他的化合物活性相對較弱，提示H-5的空間構型與抗炎活性存在一定的相關性，同時N-1上的N→O鍵及D環上的雙鍵也是影響抗炎活性的部位。鷹爪豆堿在劑量為0.937 5 mg/kg時，腫脹抑制率達到了51.136 4%±2.401 1%，顯示出良好的抗炎活性。槐果堿和氧化槐果堿對小鼠腹腔毛細血管通透性有顯著的抑制活性，尾靜脈注射劑量為40 mg/kg時，抑制率分別為43.297 5% ±1.698 9%和40.680 3% ±1.510 3%;明顯優于苦參堿及槐定堿，說明D環上的C=C雙鍵為活性的主要部位。苦參及山豆根為臨床常用中藥，而其生物堿是其主要活性成分，研究其結構與活性之間的關系，對于開展苦參堿類化合物結構修飾，研發高效低毒的抗炎鎮痛藥物具有一定的參考意義。

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