三黃散瘀巴布劑中大黃與黃芩的提取工藝研究

尹 華， 章建華， 許叢輝， 劉云飛， 王 玲

(1.浙江中醫藥大學藥學院中藥標準化研究實驗室，浙江杭州 310053;2.浙江中醫藥大學附屬第一醫院，浙江杭州 310006)

三黃散瘀巴布劑由大黃、黃芩和黃柏等藥味組成，具有活血祛瘀、行氣止痛、消腫散結的作用，可用于治療軟組織損傷。現代研究表明，大黃具有抗腫脹、抗菌消炎和免疫作用，其活性成分為蘆薈大黃素、大黃酸等蒽醌類成分［1-2］;黃芩具有消炎作用，其主要活性成分為黃芩苷［3］等黃酮類成分。透皮吸收試驗發現，大黃中游離蒽醌與結合蒽醌、黃芩中的黃芩苷均可以透過皮膚角質層，產生藥效，因此，本實驗選用上述成分的轉移率作為評價指標進行制備工藝的考察，對方中各藥味均建立了評價指標，可全面客觀反映制備工藝各因素的影響。

根據課題組前期實驗研究，已知大黃與黃芩合提，黃柏單獨提取更有利于藥效成分的提出 (相關數據整理成文待發表)，故本試驗采取大黃、黃芩合提，黃柏單提的方法。以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚和黃芩苷等多個指標的轉移率為評價指標，結合綜合加權評分法篩選優化提取工藝。

1 材料、儀器及試劑

1.1儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀 (美國安捷倫);Sartorius BD211D十萬分之一電子天平 (德國塞多利斯);Sartorius BS110S萬分之一電子天平 (德國塞多利斯);CLAUVFM純水機 (英國 ELGA);旋轉蒸發儀 (上海申生);KQ5200B型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2材料與試劑 蘆薈大黃素對照品、大黃酸對照品、大黃素對照品、大黃酚對照品、大黃素甲醚對照品、黃芩苷對照品 (中國藥品生物制品檢定所，供定量測定用，批號分別為:110795-200605、0757-200206、0756-200211、110796-200310、110758-2-509、110715-200514);大黃 (20091030，20070822，20070727，甘肅 掌葉大黃)、黃芩 (20091030，20071003，20070119，內蒙古)分別購自華東醫藥有限公司和浙江中醫藥大學中藥飲片廠，經浙江中醫藥大學藥學院張如松教授鑒定為正品，符合2005年版《中國藥典》(一部)規定;甲醇 (色譜純，美國TEDIA公司);水為過0.2 μm濾膜的純水;其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

結合處方中各藥味的理化性質［1-4］:黃柏中的主要有效成分鹽酸小檗堿為季銨鹽，大黃中蒽醌類成分和黃芩中有效成分黃芩苷都呈酸性，可以與鹽酸小檗堿形成鹽，沉淀析出，所以若將三者合提會降低有效成分轉移率，因此黃柏適合單獨提取，大黃中的蒽醌類成分與黃芩中黃芩苷結構相似適合合提，本試驗前期對各藥味的配伍提取方式進行考察，大黃、黃芩、黃柏單提、兩兩合提、三藥合提;結果表明大黃和黃芩合提，黃柏單獨提取時，各指標成分的轉移率均較高，提取率亦均高于其它配伍提取方式 (相關數據整理成文待發表)。故而確定大黃和黃芩合提，黃柏單提。以君藥大黃中蒽醌類成分和臣藥黃芩中黃芩苷的轉移率作為評價指標，采用多指標綜合加權評分法 (蘆薈大黃素∶大黃酸 ∶大黃素 ∶大黃酚 ∶大黃素甲醚 ∶黃芩苷的權重系數為0.12∶0.12∶0.12∶0.12∶0.12∶0.4)，對各工藝參數進行考察，優化提取工藝，并對最佳工藝進行驗證試驗。

2.1 蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的測定［5-6］

2.1.1 色譜條件 Agilent 1200高效液相色譜儀 (DAD);Zorbax Eclipse SB-C18色譜柱 (4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫 (見表1);檢測波長254 nm;體積流量1.0 mg/mL;柱溫25℃;進樣量10 μL，理論塔板數以大黃素峰計不低于3 000。

表1 梯度洗脫程序

2.1.2 標準曲線的制備 取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，精密稱定，加甲醇配成質量濃度分別為0.214 5、0.156 8、0.187 7、0.374 0、0.110 5 mg/mL的混合對照品貯備液。精密吸取上述混合對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。按2.1.1項下色譜條件分別進樣10 μL，測定。以質量濃度X(mg/mL)分別對峰面積Y進行線性回歸，得蘆薈大黃素回歸方程為:Y=34.95X+0.769 6(r=0.999 4)，線性范圍為2.145～21.45 mg/mL;大黃酸回歸方程為:Y=36.88X-8.289(r=0.999 8)，線性范圍為1.568～15.68 mg/mL;大黃素回歸方程為:Y=32.49X-0.412 0(r=0.999 4)，線性范圍為1.877～18.77 mg/mL;大黃酚回歸方程為:Y=39.31X-8.20(r=0.999 7)，線性范圍為3.740～37.40 mg/mL;大黃素甲醚回歸方程為:Y=17.37X-3.438(r=0.999 5)，線性范圍為1.105～8.842 mg/mL。

2.1.3 加樣回收試驗 精密吸取已知含有量的提取液0.5 mL，分別精密加入蘆薈大黃素對照品溶液 (0.107 2 mg/mL)0.10 mL，大黃酸對照品溶液 (0.078 4 mg/mL)0.11 mL，大黃素對照品溶液 (0.093 8 mg/mL)0.08 mL，大黃酚對照品溶液 (0.187 0 mg/mL)0.11 mL，大黃素甲醚對照品溶液 (0.055 2 mg/mL)0.12 mL，按2.1.4項樣品測定項下供試液的制備方法平行制備6份，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結果表明蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均回收率分別為100.3%(RSD為2.2%，n=6)、101.3%(RSD為2.5%，n=6)、100.5%(RSD為2.2%，n=6)、100.8%(RSD為1.5%，n=6)、98.48%(RSD為2.9%，n=6)，均符合要求。

2.1.4 樣品測定 精密吸取各工藝提取液1.0 mL，每批平行取2份，加8%鹽酸溶液10 mL，三氯甲烷10 mL，水浴加熱回流1.0 h，放冷，轉移至分液漏斗中，靜置、分層，取三氯甲烷層，水層再用三氯甲烷萃取2次，每次10 mL，合并三氯甲烷層，回收三氯甲烷，殘渣加甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，過膜即得，按2.1.1項下色譜條件進樣10 μL測定。與同批藥材比較，計算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含有量及轉移率。色譜圖見圖1。

圖1 對照品 (A)和提取液 (B)HPLC色譜圖

2.2 黃芩苷測定［4，7］

2.2.1 色譜條件 Agilent 1200高效液相色譜儀 (DAD);Zorbax Eclipse SB-C18色譜柱 (4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動相:甲醇-0.2%磷酸，梯度洗脫見表2;檢測波長280 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫25℃;進樣量10 μL，理論塔板數以黃芩苷峰計不低于2 500。

表2 梯度洗脫程序

2.2.2 標準曲線的制備 取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇配成1.130 mg/mL的黃芩苷對照品貯備液;精密吸取此貯備液1.0 mL，加甲醇定容至10 mL，搖勻，配成0.113 0 mg/mL的黃芩苷對照品溶液;精密吸取對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、8.0 mL置10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。按2.2.1項色譜條件進樣10 μL，測定。以黃芩苷的質量濃度X(mg/mL)對峰面積Y進行線性回歸，得回歸方程為:Y=31.00X-32.65(r=0.999 8)，表明黃芩苷在5.60～90.40 mg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.3 加樣回收試驗 精密吸取已知含有量的提取液0.5 mL，精密加入黃芩苷對照品溶液 (1.130 mg/mL)0.8 mL，按2.2.4項下供試品溶液的制備方法平行制備6份，按2.2.1項色譜條件進樣10 μL，測定，計算加樣回收率。結果表明黃芩苷的平均回收率為102.1%(RSD為1.7%，n=6)，符合要求。

2.2.4 樣品測定 精密吸取各藥液1.0 mL，每批平行2份，用流動相溶解并定容至10 mL，再精密吸取1.0 mL加流動相定容至10 mL，搖勻，過膜即得，進樣10 μL測定，與同批飲片比較，計算提取液中黃芩苷的含有量及轉移率。色譜圖見圖2。

2.3 單因素試驗

2.3.1 提取方法的考察 取大黃、黃芩飲片3份，每份各為25 g，加8倍量60%乙醇，分別采用冷浸 (浸泡24 h)、超聲 (2次，每次60 min)、回流 (2次，每次1.5 h)法進行提取，將各醇提液回收乙醇并濃縮至0.05 g(總生藥量)/mL，測定各提取液中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚和黃芩苷的含有量，計算其轉移率，結果見表3，回流提取效率明顯優于冷浸法和超聲法，故選擇回流提取法。

圖2 對照品 (A)和提取液 (B)HPLC色譜圖

表3 提取方法考察結果(n=2)

2.3.2 提取溶劑的考察 根據處方中各藥味所含有效成分的理化性質，考察水和60%乙醇兩種提取溶劑。取大黃、黃芩飲片3份，每份各為25 g，加8倍量水或60%乙醇溶液，回流提取2次，每次1.5 h，提取液減壓濃縮至0.05 g(總生藥量)/mL，測定提取液中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、黃芩苷的含有量，并計算轉移率，結果見表4。由表可知，60%乙醇溶液回流的提取效率優于水提取，故確定以60%乙醇作為提取溶劑。

表4 提取溶劑考察結果(n=2)

2.3.3 溶劑用量的考察 取大黃、黃芩飲片3份，每份各為25 g，分別加8、10、12倍量60%乙醇溶液，回流提取1.0 h，提取2次，提取液減壓濃縮至0.05 g(總生藥量)/mL，測定提取液中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、黃芩苷的含有量并計算轉移率，結果見表5。結果表明，隨溶劑用量增加，提取效率增高，但10倍與12倍量溶劑并無顯著差異，從成本及能耗角度考慮，確定用10倍量溶劑。

表5 溶劑用量考察結果 (n=2)

2.4 正交試驗 稱取大黃、黃芩飲片9份，每份各25 g，以10倍量60%乙醇溶液回流提取，采用L9(34)正交試驗法［1-2］，考察回流時間、含乙醇量和提取次數等因素對蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚和黃芩苷轉移率的影響，提取液中5種蒽醌類成分和黃芩苷的轉移率的測定結果見表6，以多指標綜合加權評分法 (蘆薈大黃素∶大黃酸∶大黃素 ∶大黃酚 ∶大黃素甲醚 ∶黃芩苷的權重系數為0.12∶0.12∶0.12∶0.12∶0.12∶0.4)評價，實驗結果的直觀分析和方差分析見表6、表7。

直觀分析顯示:各因素作用主次為A(提取次數)＞B(回流時間)＞C(含乙醇量);方差分析顯示:因素A(提取次數)、B(回流時間)的影響有顯著性差異，因素C(含乙醇量)的影響無顯著性差異，則兩者的較佳提取工藝為:A3B3C2，即加10倍量60%乙醇溶液，回流提取3次，每次1.5 h。選擇A3B3C2作為方案進行驗證試驗。

表6 大黃與黃芩合提工藝L9(34)正交試驗結果

表7 方差分析

2.5 驗證試驗 稱取大黃、黃芩飲片3份，每份各25 g，按優化的提取工藝 (10倍量60%乙醇溶液，回流提取3次，每次1.5 h)提取，測定提取液中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、黃芩苷的含有量及轉移率，驗證最佳提取工藝的合理性，3份提取工藝的驗證試驗結果見表8，各成分提取均較完全，且重復性較好，表明正交試驗得到的提取工藝切實可行。

表8 大黃與黃芩合提工藝驗證試驗結果(n=3)

3 討論

3.1 提取工藝的考察［1-3］根據處方中各藥味中有效成分的理化性質，黃柏中主要有效成分鹽酸小檗堿為季銨鹽，大黃中蒽醌類成分和黃芩中黃芩苷均呈酸性，三者合提易形成鹽，沉淀析出，會降低有效成分的轉移率。因此進行了各藥味配伍提取方式考察 (大黃、黃芩、黃柏單提、兩兩合提、三藥合提)，以各成分轉移率和提取率為指標，結果表明大黃、黃芩合提，黃柏單提較優，故最終確定以大黃、黃芩合提，黃柏單提為提取工藝。

3.2 評價指標的選擇及權重系數的確定 中藥各成分多且復雜，而復方由多味中藥組成，其成分也就更為復雜，因此在進行制備工藝考察時，評價指標的確定尤為關鍵。本試驗采用了多味藥有效成分 (指標成分)的轉移率作為評價指標，結合綜合加權評分法，進行工藝優化。考慮到大黃為君藥，起主要作用，黃芩為臣藥，且結合組方的量，大黃與黃芩合提工藝的正交試驗采用多指標綜合加權評分法評價，確定蘆薈大黃素 ∶大黃酸 ∶大黃素 ∶大黃酚 ∶大黃素甲醚;黃芩苷轉移率的權重系數為0.12∶0.12∶0.12∶0.12∶0.12∶0.4，既反映大黃君藥的作用，又體現君、臣藥的作用強度，與中醫藥理論相符合。

4 結論

本實驗采用單因素和正交試驗法，測定方中君、臣藥的有效成分蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、黃芩苷的轉移率，借助多指標綜合加權評分法，優化三黃散瘀巴布劑中大黃與黃芩合提的提取工藝。所優選的工藝合理可行穩定，且重現性好，有效成分能較好地被提取出來;另一方面，本實驗對方中的兩味藥建立了綜合評價指標，較傳統的以單一化學成分的轉移率或浸膏得率來衡量制備工藝更為全面合理。

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