HPLC法同時測定八號膏中大黃素和大黃酚

高 建， 趙 萍， 夏 泉， 許杜娟，2， 高昌琨

(1.安徽醫科大學第一附屬醫院，國家中醫藥管理局三級實驗室安徽合肥 230022;2.安徽醫科大學藥學院安徽合肥 230032;3.安徽中醫學院藥學院安徽合肥 230038)

眾所周知，燒傷可引起嚴重的皮膚損害。中藥在燒傷治療上有其獨特優勢［1-2］，八號膏是安徽醫科大學第一附屬醫院在上世紀七十年代中西醫結合治療燒傷的研究成果之一，是治療燒傷的特色中藥制劑，具有清熱解毒、收斂生肌等功效，主要治療深Ⅱ度燒傷，大量的臨床使用證明其效果顯著。八號膏處方由大黃、地榆、五倍子等中藥組成，由于其處方組成復雜，至今仍沒有明確的質量標準，嚴重制約其進一步開發和利用，因此對其中主要成分質量控制的研究十分迫切。

大黃具有涼血解毒、逐瘀通經［3］的功效。現代研究表明［4］大黃中的活性成分具有瀉下、抗炎、抗菌、抗病毒等作用;此外通過大量閱讀文獻發現，大黃、冰片等中藥在燒燙傷治療中的使用頻率最高。故為建立該制劑的定量分析方法，更好地控制質量，對該制劑進行了定量測定方法的研究，本試驗選取大黃中大黃素和大黃酚為指標，運用目前使用廣泛的HPLC法進行測定。

1 儀器與試藥

Agilent 1100(美國)高效液相儀;Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μL，迪馬科技公司)色譜柱;AB135-S十萬分之一電子天平 (梅特勒-托利多中國地區生產);SB3200超聲波清洗器 (必能信超聲公司);電熱恒溫水浴鍋 (上海醫療器械五廠)。

八號膏 (安徽醫科大學第一附屬醫院制劑中心生產，批號:20111021，20120110，20110724，20110821，20111222，20110623，20110305，20110725);大黃素對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號:110756-200110)、大黃酚對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:11796-200615)、大黃酸對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號:110757-200206)、蘆薈大黃素對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號:110795-200806)、大黃素甲醚對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號:110758-200611)。甲醇 (色譜純，美國Tedia公司)，滅菌注射用水 (超純水，湖南科倫制藥有限公司);甲醇 (分析純，上海潤捷化學試劑有限公司)，85%磷酸，石油醚溶液等。

2 方法與結果

2.1色譜條件 DiamonsilC18(4.6 mm×250 mm，5 μm，迪馬科技公司)，phenomenex保護柱，柱芯 (3 mm×4 mm);流動相為甲醇-0.1%磷酸 (85∶15)，進樣量10 μL;檢測波長254 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃。在此條件下大黃樣品中兩種對照品與其他組分均能達到基線分離，見圖1。

圖1 對照品 (A)、制劑 (B)、大黃對照藥材 (C)和陰性對照 (D)HPLC色譜圖

2.2 對照品溶液 精密稱取大黃素對照品和大黃酚對照品適量，加入甲醇溶液定容，制成大黃素質量濃度為0.105 g/L，大黃酚質量濃度為0.103 g/L的對照品貯備液。

2.3 供試品溶液 取八號膏約5 g，精密稱定，加45 mL 20%硫酸，超聲20 min酸化;于3 000 r/min離心機中離心10 min，棄去酸液后，濾渣加40 mL石油醚超聲15 min濾過，濾渣加20 mL石油醚超聲15 min，濾過，合并兩次石油醚溶液，于60℃下揮干溶劑，加甲醇溶解后定容至10 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液 按照八號膏的制備工藝，制備缺少大黃的陰性樣品，并按2.3項下方法制成陰性對照溶液。

2.5 線性關系考察 精密稱取大黃素對照品貯備液，甲醇稀釋至5種不同質量濃度的對照品溶液;精密稱取大黃酚對照品貯備液，甲醇稀釋至5種不同質量濃度的對照品溶液。以上系列標準溶液在2.1項下色譜條件下，進樣10 μL，測定各組分峰面積。以峰面積為縱坐標 (Y)，以進樣量 (μL)為橫坐標 (X)，繪制標準曲線，計算其回歸方程及線性范圍。大黃素:Y=2 301X-9.604 1，r=0.999 9，線性范圍:0.016 41～0.522 μg;大黃酚:Y=420 6.8X-15.55，r=0.999 9，線性范圍:0.016 10～0.515 μg。

2.6 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，連續進樣6次，記錄峰面積，大黃素、大黃酚的日內精密度RSD(n=5)分別為0.35%、0.15%。精密吸取相同對照品溶液10 μL，連續進樣3 d，每天3次，記錄峰面積，大黃素、大黃酚的日間精密度RSD分別為0.27%、0.37%。

2.7 穩定性試驗 取同一供試品溶液，在相同色譜條件下，分別在0、2、4、6、12、24 h進樣，測得大黃素峰面積RSD為2.7%(n=6)、大黃酚峰面積RSD為2.9%(n=6)，結果表明，供試品溶液在24 h內穩定。

2.8 重復性試驗 取同一批號供試品，按2.3項下供試品溶液制備方法制備6份，在上述相同色譜條件下進行測定，測得供試品中大黃素峰面積RSD為2.7%(n=6)，大黃酚峰面積RSD為2.1%(n=6)。

2.9 加樣回收率試驗 精密稱取八號膏6份，按2.3項下制備供試品溶液，在相同色譜條件下進行測定，測得其中大黃素和大黃酚的濃度。分別精密移取上述溶液各100 μL，精密加入混合對照品溶液100 μL，進樣量為10 μL，分別計算大黃素和大黃酸的加樣回收率，結果見表1。

2.10 供試品定量測定 取8個批次的八號膏，按2.3項下制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL，按上述色譜條件，每批次供試品溶液分別連續進樣3次，分別計算每批次供試品溶液中大黃素、大黃酚的平均質量分數及RSD，并計算大黃素和大黃酚的相對保留值，結果見表2。

表1 加樣回收率實驗結果 (n=6)

表2 不同批次八號膏測定結果 (n=8)

3 討論

3.1 提取方法的選擇［5-7］經甲醇、乙醇、三氯甲烷等提取溶劑以及超聲、回流等提取方法比較，發現酸化后，加熱回流方法破壞了一部分蒽醌類成分;由于超聲提取在常溫下進行，較之加熱回流方法，蒽醌類成分不容易被破壞且提取更完全，因此選擇超聲法進行提取。

3.2 流動相的選擇 通過閱讀參考文獻 ［8-12］和查閱2010年版《中國藥典》［3］，以及預實驗中使用的流動相如:甲醇-0.1%磷酸 (85∶15)、甲醇 -乙腈 -0.1%磷酸(23∶42∶35)、乙腈-0.1%磷酸 (85∶15)等，最終選擇甲醇-0.1%磷酸 (85∶15)為流動相，分離完全，峰形較好且出峰時間最短，適合對八號膏中兩種蒽醌類成分的同時測定。

3.3 實驗意義 燒傷制劑八號膏由大黃、地榆、五倍子等中藥組成，其中大黃為主藥之一。其含有游離的蒽醌類衍生物如大黃素、大黃酚、大黃酸等，它們對多種病毒和細菌具有抑制和殺滅作用［4］。所以制劑中大黃有效成分含有量的高低是評價其質量的重要標準之一。蒽醌類含有量測定方法文獻報道較多，但多集中在大黃藥材中蒽醌類成分的含有量測定，提取方法和色譜條件多種多樣;而制劑則往往是單一成分的測定。經過多次預實驗發現，八號膏制劑中含有5種蒽醌類成分，其中大黃素、大黃酚的含有量均較高，其余3種成分含有量較低，故本實驗選擇大黃素、大黃酚作為含有量測定的指標成分，對燒傷制劑八號膏中大黃的含有量測定方法進行研究，為八號膏及含有大黃的中藥制劑的質量標準的制定提供實驗依據。

［1］袁 汀，周瑜妹.外用中藥治療燒燙傷的研究進展［J］.光明中醫，2010，25(11):2151-2153.

［2］陸樹良.燒傷創面愈合的理論探索與臨床實踐［J］.中華燒傷雜志，2008，24(5):359-361.

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:20.

［4］王 磊，張靜澤，高文遠.大黃活性成分藥代動力學研究進展［J］.中成藥，2011，33(9):1571-1574.

［5］李志梅，HPLC法測定致康膠囊中大黃酸、大黃素和大黃酚的含量［J］.海峽藥學，2012，22(7):102-103.

［6］劉善心，馬 毅，鐘方曉，等.HPLC法測定復方大黃利膽片中大黃素、大黃酚的含量［J］.中國實驗方劑學雜志，2007，13(12):13-14.

［7］陳廣通，汪東庚，李玉琴.王氏保赤丸中大黃5種成分的HPLC測定［J］.長春中醫藥大學學報，2011，27(1):20-21.

［8］賀凡珍，蔡學瑩，彭 維，等.HPLC法同時測定酒大黃中5種蒽醌的含量［J］.中藥材，2011，34(9):1384-1385.

［9］李鑫健，方翠芬，祝 明.HPLC法同時測定利膽排石片中大黃素、大黃酚及大黃素甲醚［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，23(17):82-84.

［10］匡學海，董小萍，石任兵，等主編.中藥化學［M］.北京:中國中醫藥出版社，2010:71.

［11］Gao Xiaoyan，Jiang Yong，Lu Jianqiu ，et al.One single standard substance for the determination of multiple anthraquinone derivatives in rhubarb using high-performance liquid chromatography-diode array detection［J］.J Chromatogr A，2009，1216(11):2118-2123.

［12］陳興田，黃金華.HPLC法測定導赤丸中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量［J］.中國醫藥指南，2011(27):179-180.