大葉藻（Zostera marina L.）胚的結構和種子萌發過程的研究＊

田萍萍，劉延嶺，崔翠菊，梁廣津，李 霞，賽 珊，錢冠蘭，王宏梅

（山東東方海洋科技股份有限公司，山東 煙臺264003）

大葉藻（Zostera marina L.）胚的結構和種子萌發過程的研究＊

田萍萍，劉延嶺，崔翠菊，梁廣津，李 霞，賽 珊，錢冠蘭，王宏梅

（山東東方海洋科技股份有限公司，山東 煙臺264003）

以采自山東榮成褚島桑溝灣南岸成熟的大葉藻種子為材料，研究了種子的外部形態特征、胚乳成分及胚的解剖結構，并初步了解了大葉藻種子的萌發過程。結果表明，大葉藻種子是單子葉有胚乳的種子，呈暗褐色，橢圓形或長圓形，種皮革質且有17～20條縱肋，胚乳豐厚堅硬，胚乳細胞被淀粉粒充滿；胚彎曲，由胚根、胚軸、胚芽和子葉組成，子葉U形棒狀，其彎曲部有一裂縫，胚芽位于裂縫處，胚軸較短，其下是兩個對生的胚根，有中央維管束貫穿胚根、胚軸、胚芽和子葉。在子葉出土萌發的植物類型中，大葉藻種子萌發過程是罕見的。萌發初期，子葉優先生長突破種皮而長出地面，此后胚根才開始生長并產生不定根。對大葉藻種子結構和萌發過程的研究，為探討大葉藻種子萌發和幼苗更新的限制因素提供了一定的理論依據。

胚；萌發過程；海洋高等植物；種子結構；大葉藻

大葉藻（Zostera marina L.）是一年或多年生海洋高等植物，生于潮間帶和潮下帶的淺海中，營沉水生活。其形成的廣闊海草場是近海生態系統重要的初級生產力，為許多生物提供重要的群落生境［1］。大葉藻是北半球沿海分布最廣泛的海草，在東北亞、遠東地區、歐洲與北美均有分布，國內主要分布于河北、山東、遼寧等省沿海［2－3］。近幾十年，大葉藻草場在世界范圍內大面積的消失直接導致了淺海生物棲息地的破壞，近海漁場的衰落及淺海水域生物多樣性的喪失。這次世界范圍的衰退在上世紀70－80年代起引發了全世界對這一生境的關注和研究。至今，在大葉藻研究領域內，修復生態學仍然是研究需求最為迫切最受關注的研究方向。

上世紀末，大葉藻草場的修復工作依賴于成株移栽。近年研究發現，用大葉藻種子播種較成株移栽更便于收集、儲存與運輸，大大降低了工作量及工作成本。因此，國內外學者開始將大葉藻草場的修復工作更多的寄望于種子。此時，對大葉藻種子基本生物學特性的深入了解，轉為種子移栽研究開展的必要前提。

目前，有關大葉藻種子生物學特性的研究甚少，主要集中于種子萌發影響因子的研究［4－5］，但萌發機制與環境因子的作用機理尚不清楚。對種子結構與成分的準確闡述，是了解種子適應環境條件生理過程的基礎。原永黨等［6］曾通過石蠟切片得到了大葉藻種皮棱角和胚乳的解剖結構。在此基礎上，本研究首次利用石蠟切片得到大葉藻胚的解剖結構，并結合胚的解剖結構闡釋了大葉藻種子的萌發過程。對大葉藻種子結構和萌發過程的研究，為探討大葉藻種子萌發和幼苗更新的限制因素提供了一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

大葉藻種子于2009－08采自山東榮成褚島桑溝灣南岸。采集后經過篩選，得到的成熟種子用自然海水沖洗干凈，置于10℃海水中進行暫存。

1.2 方 法

1.2.1 大葉藻種子外部形態特征的觀察

將大葉藻種子用尖頭鑷子固定在解剖鏡載物臺上進行外部形態特征觀察。

1.2.2 大葉藻胚的石蠟切片

1.2.2.1 取材與固定

將用海水浸泡7～10d的成熟種子去掉種皮和胚乳，獲得完整的胚。將胚放入FAA固定液固定48h。

1.2.2.2 梯度酒精脫水

固定好的胚依次入50%酒精、70%酒精、80%酒精、95%酒精和無水乙醇中做脫水處理，各級間隔2h。

1.2.2.3 透明、浸蠟、包埋

將脫水后的材料置入無水乙醇／二甲苯（1∶1）混合液30min，然后在二甲苯中進行透明處理約10min。

隨后，把材料入二甲苯／石蠟（1∶1）混合液30min，再放入58℃熔融的純蠟（Ⅰ）→純蠟（Ⅱ）中各浸蠟45min。

將浸蠟后的材料放入恒溫箱中保持58℃，用包埋劑進行常規石蠟包埋。

1.2.2.4 切片、展片

修整蠟塊后，在RM2015型輪轉式切片機上進行常規石蠟連續切片，切片厚度為10μm。將連續切片浮在40℃水浴鍋中展片，用涂有甘油蛋白的載玻片附片后室溫晾干。

1.2.2.5 脫蠟、復水

充分干燥的切片先后入二甲苯（Ⅰ）和二甲苯（Ⅱ）進行脫蠟處理20min和10min。

脫蠟后的切片依次入二甲苯／無水乙醇（1∶1）混合液、無水乙醇、95%酒精、80%酒精、70%酒精和50%酒精各5min進行復水。

1.2.2.6 蘇木精－伊紅染色

復水后的切片先用蘇木精染色5min，然后依次入50%酒精、70%酒精和80%酒精各5min進行脫水處理。脫水后的切片依次入10%的伊紅酒精溶液染色1min，然后依次入95%酒精（Ⅰ）各5min、95%酒精（Ⅱ）5min、無水乙醇（Ⅰ）5min，無水乙醇（Ⅱ）各5min洗去非特異性的著色。

1.2.2.7 封片、觀察

將染色切片依次入二甲苯／無水乙醇（1∶1）混合液5min、二甲苯（Ⅰ）10min、二甲苯（Ⅱ）20min進行透明處理，并采用中性加拿大樹膠封片，日產Olympus倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.2.3 胚乳的組織化學成分鑒定

將新鮮種子的胚乳做徒手切片，用I2－KI試劑滴染鑒定淀粉和蛋白質，呈藍色為淀粉，呈黃色為蛋白質；用蘇丹Ⅲ染色鑒定脂肪，呈紅色為脂肪。

1.2.4 觀察大葉藻種子萌發和幼苗形成的過程

為考察大葉藻胚各部分結構發育的歷程，將部分成熟種子置于10℃無陽光直射的自然海水中，逐日觀察大葉藻種子萌發和幼苗形成的過程。

2 結 果

2.1 種子的外部形態特征

大葉藻種子呈暗褐色，長約4mm，橢圓形或長圓形，合點端圓鈍珠孔端有凹陷。種皮外層革質，上具清晰縱肋17～20條延伸至兩端，內層膜質光滑易與胚乳剝離。

2.2 胚乳的成分鑒定

成熟的種子胚乳豐厚堅硬。由I2－KI試劑染色（圖1），除少數胚乳細胞中空，其他胚乳細胞均被染成藍色的淀粉粒充滿，未見蛋白質和脂肪貯存。

圖1 胚乳細胞經I2－KI試劑染色（×800）Fig.1 Endosperm cell stained with I2－KI reagent（×800）

2.3 胚的解剖結構

由大葉藻胚縱切片可見（圖2a，2b），大葉藻胚彎曲，由胚根、胚軸、胚芽和子葉組成。子葉一片，U型棒狀，占整個胚體體積和解剖結構的85%以上，而胚根、胚軸和胚芽位于子葉的彎曲部，僅占不足15%。由胚縱切圖可見（圖2c），胚根細胞與鄰近的胚軸細胞表現為明顯不同的外形。胚軸由較胚根細胞體積稍大的分生細胞構成，長度較短，兩端分別連接胚芽與胚根，側面連接子葉。

圖2 大葉藻胚的石蠟切片Fig.2 Paraffin Section of Embryo of Zostera marina L.

由子葉橫切可見（圖2d），其外層表皮細胞排列致密，內部葉肉細胞體積大、核小、細胞質濃厚、胞間隙大，中央是由胚芽和胚根分生組織分化出的中央維管束。在胚縱切的連續石蠟切片中可見中央維管束貫穿胚根、胚軸、胚芽和子葉。

由胚芽連續橫切切片可見（圖2e），其最外層表皮細胞排列整齊，內部散布肉細胞、氣道及中央有維管束。在胚芽的基部背向子葉的彎曲部一側有一裂縫，是幼葉生長向外伸出的部位。

由胚根縱切可見（圖2f），胚有兩個對稱排列的胚根，呈圓錐狀，朝向表皮。其尖端生長點由體積小且排列緊密的分生細胞組成。細胞質濃厚、核大。生長點以上的細胞體積較大且伸長，整齊排列成傘狀，列間隙較大。

2.4 大葉藻種子萌發和幼苗形成

在10℃無陽光直射的自然海水中，大葉藻種子經7～10d放置開始萌發。由圖3可見，大葉藻種子的萌發從子葉開始，首先子葉伸長突破種皮，在伸長到可以接受足夠光照的時候，胚芽發育而來成的2～3片嫩綠的幼葉才從子葉的裂縫處伸長并生長，其生長所需的營養物質來自胚乳。此時伸長的子葉仍是白色的，其與幼葉連接處有一胚軸發育而成的節點。此后胚根開始發育，在節點處長出一對對生根。種子攜帶的營養物質完全耗盡后，子葉與胚乳脫落，形成具有完整的根莖葉結構的幼苗。

圖3 大葉藻種子萌發過程ig.3 Seed germination of Zostera marina L.

3 討 論

3.1 胚、胚乳和種皮對種子萌發的影響

種子在適宜條件下，是否能夠萌發主要取決于種子的成熟度，

種子成熟應具備生理方面的成熟和胚形態的完全建成。成熟胚在形態上應分化形成完整的子葉、胚芽、胚軸和胚根四部分。實驗觀察大葉藻種子胚在形態上已分化成熟，在形態上不會影響種子的萌發。大葉藻種子是單子葉有胚乳的種子，胚乳中含有豐富的淀粉，為其胚的發育提供了足夠的營養儲備。

種子萌發有個吸水膨脹的過程，較堅硬的胚乳會導致種子的吸水過程緩慢，使萌發過程遲緩。大葉藻種子較堅硬的革質種皮會對種子萌發產生機械阻力，使種胚難以沖破種皮，發芽整齊度和出苗率降低。另外，革質的種皮會阻礙水分和氣體的滲透，使胚得不到發芽所需的水分和氧氣，而使種子強迫性休眠。所以，較堅硬的胚乳和革質的種皮可能是種子萌發的外部限制因素。

3.2 幼苗的形成

在子葉出土萌發的植物類型中，大葉藻種子萌發過程是罕見的。萌發初期，子葉優先生長，首先突破種皮長出地面，隨后胚根才開始生長并產生不定根。Fishman和Orth［7］，Orth等［8］曾報道大葉藻幼苗的成活率不足10%。自然條件下大葉藻營養體形成的冠層引起營養和光照的競爭，從而限制了幼苗生長，即使種皮可能經較長時間降解而萌發，幼苗成活率可能極低或不能成活。王孝民等［9］認為水深是限制多年生沉水植物微齒眼子菜（Potamogeton maackianus）幼苗成活的一個關鍵因素。隨水深增加，光照減弱，幼苗真葉形成、不定根產生前，由于光合作用不足，導致營養缺乏而死亡。Van Wijk［10］認為沉水植物篦齒眼子菜（potamogeton pectinatus）的幼苗能長成成熟個體取決于幼苗所處地點的植被情況。本研究認為，大葉藻種子完全具有在潮間帶或潮下帶的淺海、植被稀疏的地點，產生幼苗進而長成成熟個體的較大潛力。在對幼苗生長的過程中觀察發現，在子葉和胚乳還未脫落之前，圍繞胚乳的外側會長出一叢須狀物，幼苗通過這種須狀物交織在一起生長。在隨海流擴散的過程中，遇到合適的基質可以附著后扎根生長，起固著器的作用，這也是與海洋沉水生活相適應的結果。

3.3 種子的休眠

種子是一個處于休眠狀態的有生命的活體，它受內在或外在因素的限制，短時間內存在不能萌發或萌發困難的現象，這是植物對外界條件長期形成的一種適應性。大葉藻種子在不利環境下也具有休眠的特性，休眠時間可長達一年之久［8］。Van和 Verschuure［11］及 Meling－lopez和Ibarra－Obando等［12］曾報道在大葉藻的有性繁殖中，其種子產量在時間和空間上都是不可預知的。大葉藻屬于海洋沉水種子植物，種子成熟后或落于海底沉積層上，或隨水流沖到其它地方，在此過程中絕大部分被多種原因（菌類侵襲，動物捕食與破壞以及其他物理、化學條件的影響）破壞掉了，還有一部分處于休眠狀態的種子則埋藏于海底沉積物中成為大葉藻種子庫，在合適的干擾作用下對退化生態系統的恢復以及植被更新發揮重要的作用，對大葉藻種子休眠特性的研究，對種子保存和促萌發有很大的現實指導意義。

致謝：東方海洋科技股份有限公司國家海藻工程研究中心處對本研究進行過程中提供的幫助，李曉捷老師、羅世菊老師及江鑫博士等各位工作人員的指導和幫助。

（References）：

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（王佳實 編輯）

Study on Embryo Structure and Seed Germination of Zostera marina L.

TIAN Ping－ping，LIU Yan－ling，CUI Cui－ju，LIANG Guang－jin，LI Xia，SAI Shan，QIAN Guan－lan，WANG Hong－mei
（Shandong Oriental Ocean Sci－Tech Co.，Ltd，Yantai 264003，China）

Seed morphological character，endosperm components and embryo structure of the Zostera marina L.were studied using the materials collected from south bank of Sanggou Bay，Rongcheng Zhudao in Shandong province.The process of the seed germination was also studied in this paper.The results showed that Zostera marina L.is monocotyledon.The testa is leathern and has17－20longitudinal ribs.Its seed contains dark brown endosperm in ellipse or egg－shape.The endosperm is rich and hard，filled with starch grain.The embryo is curve and composed of radicle，hypocotyl，embryo bud and cotyledons.The cotyledons showed in U－shaped rod with embryo bud in its gap of the curved part.The hypocotyl is a little short and two opposite radicles were located underside.The central vascular bundle runs through the embryo.The seed germination process is exceptional among the epigaeous plants.In the early germination stage，the cotyledons break through the testa and grow up out of the ground，thereafter，the radicles begin to grow and produce adventitious roots.This study provided a theoretical basis for further studies on limiting factors of seed gemination and seedling of Zostera marina L..

embryo；germination；marine higher plants；seed structure；Zostera marina L.

August 25，2011

Q174

A

1671－6647（2012）03－0402－06

2011－08－25

國家海洋局開放基金——典型水域清潔生產與環境安全技術與示范（200905020－12）；山東省科技發展計劃項目——人工大

葉藻場構建的生物學研究（2010GSF10612）；煙臺市科學技術發展計劃項目——人工大葉藻場構建的生物學研究（2009211）

田萍萍（1983－），女，山東德州人，碩士，工程師，主要從事海洋生物學方面研究.E－mail：pptian2010@163.com