雪卡毒素的提取純化方法初步研究＊

閆鴻鵬，張彩霞，趙肅清，張 焜

（廣東工業(yè)大學，廣東 廣州510006）

雪卡毒素的提取純化方法初步研究＊

閆鴻鵬，張彩霞，趙肅清＊，張 焜

（廣東工業(yè)大學，廣東 廣州510006）

雪卡毒素（ciguatoxin）是一類具有神經毒性的海洋藻類毒素，高純度雪卡毒素是開展其相關研究的物質基礎。以石斑魚肝臟為原料，對其脂溶性粗提物經Florisil柱和Sephadex LH－20柱純化后，用高效液相色譜／質譜（HPLC／MS）和細胞毒性方法對其進行鑒定，證明為太平洋雪卡毒素（P－CTX－1）。HPLC鑒定分析提取物與太平洋雪卡毒素（P－CTX－1）具有相同的保留時間。HPLC／MS檢測表明純化樣品在m／z＝1 111.3和m／z＝1 133.0處出現(xiàn)雪卡毒素［M＋H］＋峰和［M＋Na］＋峰，與已有的P－CTX－1分子離子峰完全吻合。四甲基偶氮唑藍法（MTT）細胞毒性試驗證明了雪卡毒素樣品對人神經母細胞瘤（SK－N－SH）具有毒性作用，毒素劑量與細胞生長抑制率成線性關系。細胞毒性試驗進一步確認該提取物為雪卡毒素，且純度較高。

雪卡毒素；提取；純化；HPLC／MS；MTT

雪卡毒素（ciguatoxin，CTX）是一類可引起人類中毒的海洋珊瑚魚毒素［1］，主要來自于劇毒岡比亞藻（Gambierdiscus toxicus），可通過食物鏈，由小魚到大魚層層傳遞積累。太平洋雪卡毒素－1（結構式如圖1）無論從數(shù)量上以及毒性上都是最主要的雪卡毒素，在總致死率上約占90%，在我國深圳、廣州等地每年因食用含雪卡毒素石斑魚而中毒的超過2 000人［2－3］，是造成我國雪卡毒素食物中毒的主要亞型。制備高純度的雪卡毒素對開展其相關研究至關重要，但是雪卡毒素在魚體內含量極低，提純雪卡毒素相當困難，致使其標準品價格非常昂貴［4－6］。國外學者對雪卡毒素提取純化及鑒定進行了大量研究，Lewis等1991年利用有機溶劑甲醇、丙酮等從魚體內提取雪卡毒素粗提物，再經過一系列純化工藝能制得純度較高雪卡毒素，日本從1909年開始，花費49a才從珊瑚魚的卵巢中提取分離出雪卡毒素，又用了近10a才完成其工業(yè)提取的研究［7－8］，雪卡毒素純品的制備一直是國際國內研究熱點。我們以廣東汕頭、湛江等地的石斑魚魚肝為原料，初步研究了雪卡毒素的提取純化方法，采用高效液相色譜／質譜法和細胞毒性試驗［9］對純化樣品進行分析鑒定，為雪卡毒素制備及鑒定研究提供了一定依據(jù)，為開展雪卡毒素相關研究工作奠定了基礎。

1 實驗材料

1.1 材 料

雪卡毒素（P－CTX－1）標準品由澳大利亞昆士蘭大學Lewis教授實驗室提供，SK－N－SH細胞（人神經母細胞瘤）由中山大學實驗動物中心提供，石斑魚魚肝收集于廣東汕頭海濱海鮮市場、湛江霞山水產批發(fā)市場。

圖1 太平洋雪卡毒素1結構式Fig.1 Structure of P－CTX－1

1.2 實驗試劑

藜蘆定和烏本苷（深圳疾控中心惠贈）；甲醇（Methanol）、正己烷（hexane）、乙醇（ethanol）、丙酮（acetone）、三氯甲烷（Chloroform）（天津市百世化工有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）；Florisil吸附劑和Sephadex LH－20（上海源葉生物科技有限公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；RPMI－1640（GIBCO）；0.25%－EDTA胰蛋白酶（美國Amresco公司）；四甲基偶氮唑藍 （MTT，美國Sigma公司）。

1.3 儀器與設備

高效液相色譜儀采用島津LC－20A系統(tǒng)（光電二極管陣列檢測器）；LCQ DECAXP液相－電噴霧質譜儀（美國Thermo－Finniga公司）操作軟件為 Xcalliber；色譜柱：Hypesil ODS 150mm×2.1mm，粒徑為3.5 μm；RT－2100C酶標分析儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Shellab公司）；TU－1901型雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

2 實驗方法

2.1 雪卡毒素的提取

將250g魚肝切碎置于100mL的密封離心管中，70℃蒸煮20min，加適量甲醇：正己烷＝3∶1（體積比）均質［10］。加入750mL的甲醇：正己烷＝3∶1（體積比）攪拌15min，4 000r／min離心20min，棄掉上層正己烷層。重復3次，合并甲醇相，轉移到一次性注射器中，經0.45μm微孔濾膜過濾［11］，制得到雪卡毒素粗提物。真空干燥，置于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 雪卡毒素的純化

1）Florisil柱：預處理（馬弗爐600℃灼燒4h）60～100目硅鎂型吸附劑，取150g裝柱（4.5cm×45 cm）。用3Vbh∶a∶m（正己烷∶丙酮∶甲醇）＝0∶9∶1（體積比）潤洗，上樣，用5Vbh∶a∶m＝3∶1∶0（體積比）洗脫，收集洗脫液真空干燥后稱重。最后用2Vbh∶a∶m＝0∶0∶1清洗柱子。

2）Sephadex LH－20柱：取上一步得到的樣品過Sephadex LH－20柱（3cm×120cm），用三氯甲烷與甲醇（體積比為1∶1）做流動相洗脫控制流速2mL／min。分段收集洗脫液，HPLC檢測分析純化過程各部分收集液，通過比較各部分收集液的色譜圖與標準品色譜圖保留時間，確定含有雪卡毒素的部分，收集Ve／Vb＝0.41～0.48的部分樣品，真空干燥稱重。

2.3 HPLC／MS鑒定

HPLC分析條件：C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相A為乙腈，含體積分數(shù)為0.1%的甲酸；B為水，含體積分數(shù)為0.1%的甲酸；梯度洗脫：0～60%B 60min，100%B 2min；紫外檢測波長：215nm；流速0.2mL／min［12］；樣品進樣量為10μL。

質譜條件：離子源為電噴霧離子源（ESI＋）；電噴霧電壓3kV；毛細管溫度250℃；鞘氣（液氮）流速15 arb；毛細管電壓18V；溫度25℃；掃描模式：FullScan（全掃描）。

2.4 雪卡毒素細胞毒性實驗

2.4.1 細胞培養(yǎng)

人神經母細胞瘤用RPMI1640完全培養(yǎng)液（含體積分數(shù)15%的胎牛血清）37℃，體積分數(shù)5% 的CO2，95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25%－EDTA的胰蛋白酶消化傳代［13］。

2.4.2 雪卡毒素提取物的溶液配制

取高純度雪卡毒素樣品0.5mg（用0.5mL乙醇溶解，質量濃度為1mg／mL）。用細胞培養(yǎng)液稀釋配成1×105ng／mL，1×104ng／mL，1×103ng／mL，1×102ng／mL，1×101ng／mL，1ng／mL，1×10－1ng／mL的梯度稀釋液，待用。

2.4.3 最佳檢測波長及接種量的選擇

取對數(shù)生長期的人神經母細胞瘤細胞，用含體積分數(shù)為15%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液制成不同的細胞懸液后接種入96孔培養(yǎng)板中，200μL／孔。細胞數(shù)從高到底依次是4×105個／mL，2×105個／mL，1×105個／mL，5×104個／mL，2.5×104個／mL，1.25×104個／mL，6.25×103個／mL，3.125×103個／mL。每個設5個平行，并以不含細胞的完全培養(yǎng)基孔為空白對照。將細胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察細胞狀態(tài)，待其完全貼壁后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入60μL按體積比1∶6稀釋的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h待孔內形成大量深紫色沉淀。然后吸出培養(yǎng)液，每孔加入100μL DMSO，輕搖溶解其甲臜顆粒。用酶標儀分別在405nm，490nm，630nm 下測定其吸光值［14］。

2.4.4 MTT毒性實驗

接種最合適細胞數(shù)的人神經母細胞瘤細胞于96孔培養(yǎng)板中，200μL／孔，培養(yǎng)24h待細胞貼壁，每孔加配好的雪卡毒素梯度稀釋液10μL，其毒素含量分別為1 000ng，100ng，10ng，1ng，0.1ng，0.01ng，0.001 ng，每個劑量設置3個重復孔，每孔再加2μL 10mmol／L烏本苷及2μL 1mmol／L藜蘆定。3個只加提取毒素但未加激活劑（烏本苷／藜蘆定）對照孔，其毒素劑量為1 000ng。5個只加烏本苷／藜蘆定但無毒素的對照孔（10μL培養(yǎng)液代替提取毒素）；5個無毒素及激活劑的非處理對照孔（14μL培養(yǎng)液）。在培養(yǎng)10，15，20h等不同時間，每隔5h用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。每孔加入60μL按體積比1∶6稀釋的MTT，37℃培育4h。吸出培養(yǎng)基，每孔加入100μL DMSO，輕震蕩混勻。用酶標儀測定其在490nm下各孔吸光度值。測出OD值后按下列公式計算細胞生長抑制率：

抑制率（%）＝（對照組平均OD值－實驗組平均OD值）∕對照組平均OD值×100%

以雪卡毒素提取物質量濃度的對數(shù)值（lgC）為橫坐標，抑制率為縱坐標畫圖，可算出IC50值及檢測限。

3 結果與分析

3.1 HPLC／MS鑒定雪卡毒素提取物

雪卡毒素快速提取純化示意圖如圖2，從250g魚肝中制得了33.58mg的脂溶性粗提物。經Florisil柱純化后得到6.3mg提取物，經Sephadex LH－20純化后收集得到0.8mg雪卡毒素提取物。

圖2 雪卡毒素提取純化流程Fig.2 The extraction and purification process of ciguatoxin

將P－CTX－1標準品與雪卡毒素提取物在波長190～600nm下經雙光束紫外可見分光光度計掃描，兩者均在215nm處有最大吸收波長。以215nm為檢測波長，按2.3節(jié)的HPLC條件下梯度洗脫，做雪卡毒素標準品高效液相色譜（圖3），可見其在7.17min處出峰。雪卡毒素提取物的高效液相色譜圖在7.15min處也有出峰（圖4），兩者保留時間相同，結果初步說明雪卡毒素提取物中有P－CTX－1存在。

為進一步驗證雪卡毒素提取物中有雪卡毒素的存在，使用HPLC／MS掃描后結果（圖5和圖6）表明在保留時間26.9～28.6min（對應圖5中C峰）內有雪卡毒素的分子離子峰［M＋H］＋m／z 1 111.3和鈉加和離子［M＋Na］＋m／z1 133.0，與1997年Lewis［15］等從海藻中提取純化的雪卡毒素P－CTX－1吻合，可以斷定提取物中含有P－CTX－1。

圖5 雪卡毒素提取物色譜圖Fig.5 HPLC of ciguatoxin extracts

圖6 雪卡毒素提取物MS圖Fig.6 MS of ciguatoxin extracts

3.2 MTT法最佳實驗條件的選擇

MTT法在波長405nm和630nm下的OD值都很小，不能很好反映不同毒素劑量對細胞毒性影響，而490nm下測定OD值線性很好，最佳檢測波長為490nm。如圖7隨著SK－N－SH細胞數(shù)的增加OD值也隨之升高，取細胞數(shù)量與OD值為線性的區(qū)間，確定最合適的接種數(shù)量為0.5×104個／孔～4×104個／孔。在該范圍內，細胞在孔內貼壁性好，生長密度合適，生長狀態(tài)良好。

3.3 雪卡毒素提取物對細胞毒性作用

我們利用細胞毒性實驗，即利用毒素對細胞的毒性作用檢測毒素，進一步驗證雪卡毒素提取物中含有雪卡毒素。

雪卡毒素主要作用于神經末梢和中樞神經節(jié)，導致神經介質等的釋放和神經細胞膜的去極化反應，激活鈉離子通道。雪卡毒素大量聚集時由于細胞內鈉濃度增高，造成傳導受阻。烏本苷、藜蘆定激活劑對鈉離子內流具有顯著增強作用，從而引起細胞內外滲透壓的改變，使細胞變圓甚至死亡。活細胞線粒體內有一種琥珀酸脫氫酶，可作用于MTT而產生深紫色產物，因此可根據(jù)琥珀酸脫氫酶的活性推知細胞的活性［16－17］。雪卡毒素提取物對細胞作用10h時，觀察細胞形態(tài)無明顯變化，待15h時開始有變化，細胞突觸開始收縮，可以看到不同劑量毒素孔細胞死亡狀態(tài)呈梯度變化。而激活劑對照組（烏本苷／藜蘆定）的細胞形態(tài)無明顯變化。只加毒素未加激活劑的對照組在15h時細胞狀態(tài)無明顯變化，但隨著時間延長細胞死亡數(shù)在增多。

試驗組在作用20h時吸掉培養(yǎng)液，加入預先配好的MTT稀釋液。培養(yǎng)4h后490nm下檢測其吸光值（圖8），結果顯示雪卡毒素提取物對SK－N－SH細胞的毒性作用，且有很好的線性關系，IC50為200ng／mL，檢測限為0.1ng／mL。雖然神經性貝毒對細胞的作用機理與雪卡毒素作用機理相似，根據(jù)現(xiàn)有的認識，神經性貝毒在熱帶珊瑚魚體內存在的可能性很小，所以對雪卡毒素檢測沒有影響。本實驗結果與Manger［18］研究的雪卡毒素對小鼠腦神經瘤細胞（Neuro－2A）毒性實驗相符，驗證了雪卡毒素提取物的神經毒性，并能很好地反映雪卡毒素的毒性大?。?9－20］。

圖7 細胞數(shù)量與OD值之間的關系Fig.7 The curve between the amount of cells and OD values

圖8 不同濃度雪卡毒素提取物對細胞毒性Fig.8 The cytotoxicity of different concentrations of ciguatoxin extract

4 結 論

在優(yōu)化了提取、純化基礎之上，建立一種從石斑魚肝臟內快速提取純化雪卡毒素的方法，與以往的提純雪卡毒素方法相比，首先在原材料上具有毒素含量較高的優(yōu)點。雪卡毒素在魚體內不是均勻分布的，通常在于內臟、生殖腺的魚卵中含量很高，而在肌肉和骨骼中相對較低。類似可見新西蘭鯛魚肝臟中的毒素含量比肌肉高50倍，而海鱔肝臟中的毒素含量比肌肉高達100倍［21］。

其次在提取純化步驟上做了改進，每一步都做到盡量增大對雪卡毒素的提取效率，制得了純度較高的提取物。Florisil柱增大了對雜質的去除，對雪卡毒素的純化很有用，提取物到過柱后顏色變淡可以明顯看出去雜效果，但樣品的損失也會相對大些，研究中將進一步考慮使用體積小些的固相萃取柱。

本研究建立的提取純化雪卡毒素方法具有原料來源好，操作步驟少，簡單易行等優(yōu)點。所得純化物在HPLC的保留上與標準品一致，利用HPLC／MS和細胞毒性試驗鑒定所提取的樣品中有P－CTX－1存在，比傳統(tǒng)的利用小鼠生物法檢測雪卡毒素相比，具有更加靈敏、全面及能準確分析毒素成分的優(yōu)點，同時在國內首次證明了P－CTX－1在廣東沿海石斑魚體中存在。進一步的研究應通過提高純化工藝，得到更高純度的雪卡毒素。可以考慮用制備型高效液相色譜和膜分離技術。

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（高 峻 編輯）

Preliminary Study on Extraction and Purification of Ciguatoxin

YAN Hong－peng，ZHANG Cai－xia，ZHAO Su－qing，ZHANG Kun
（Guangdong University of Technology，Guangzhou 510006，China）

Ciguatoxin is a kind of neurotoxic marine algal toxins.However，ciguatoxin in high purity is the material foundation for related research.In this paper，ciguatoxin was extracted from Epinephelussp liver and purified by Florisil and Sephadex LH－20chromatography.Furthermore，this ciguatoxin was identified as Pacific ciguatoxin（P－CTX－1）by high－performance liquid chromatography／mass spectrometry（HPLC／MS）and cytotoxicity assay.This ciguatoxin has the same retention time comparing to the reference compound P－CTX－1in HPLC.The mass spectra of this ciguatoxin showed the mass peaks of 1 111.3（［M＋H］＋）and 1 133.0（［M＋Na］＋），which was fully consistent with the reported mass peaks of P－CTX－1.The cytotoxicity of ciguatoxin on the human neuroblastoma cell（SK－N－SH ）was determined by MTT assay，and the results indicated a linear dose－dependent inhibition effect of ciguatoxin on proliferation of the cells.The cytotoxicity assay further confirmed it as ciguatoxin in high purity.

ciguatoxin；extraction；purification；HPLC／MS；MTT

January 18，2011

P734.4

A

1671－6647（2012）03－0408－08

2011－01－18

國家自然科學基金 ——雪卡毒素單鏈抗體的量子點標記及濾量分析方法研究（20872020）和單鏈抗體綠色熒光觸合蛋白為基礎的雪卡毒素檢測方法研究（20672023）；廣東省自然科學基金——量子點標記雪卡毒素單鏈抗體及痕量分析方法研究（8251009001000005）

閆鴻鵬（1986－），男，河南安陽人，碩士，主要從事海洋生物毒素方面研究.E－mail：hong8peng8@163.com

＊通訊作者，教授，E－mail：suqingzhao@yahoo.com