p53RFP表達載體的構建及其對HEK293A細胞增殖的抑制作用

裴靜嫻，王月剛，張藝軍，賴文巖，吳平生

（1.南方醫科大學南方醫院心內科，廣州 510515；2.廣州軍區廣州總醫院干部病房二科，廣州 510010）

p53RFP是新發現的一個受p53轉錄調控的基因，其產物具有E3泛素連接酶活性，通過泛素化降解凋亡重要啟動信號p21WAF1，參與細胞增殖和凋亡，從而參與細胞周期的調控［1～3］。本研究擬構建p53RFP的表達載體，通過觀察其對細胞生長的影響，初步了解其生物學功能。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293A細胞（美國Invitrogen公司），SW620細胞（本研究室凍存）；DMEM培養基、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；胎牛血清（德國PAA公司）；pcDNA4/Myc-HisA、LipofectamineTM2000質粒中提試劑盒（美國Invitrogen公司），KOD-Plus-Neo（日本Toyobo公司）；限制性內切酶HindⅢ、EcoRⅠ（加拿大Fermentas公司）；T4 連接酶、DNA marker、RNAiso Plus、逆轉錄試劑盒（日本Takara公司）；膠回收試劑盒、DNA純化試劑盒、質粒小提試劑盒（美國Biomiga公司）；熒光定量PCR試劑盒（美國Roche公司）；大腸桿菌DH5α為本室凍存菌種；BCA蛋白質定量測定試劑盒（上海申能博彩公司）；鼠抗人β-actin單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），鼠抗人p53RFP單克隆抗體（臺灣Abnova公司），山羊抗小鼠辣根過氧化物酶標記二抗（HRP-labeled goat anti-mouse IgG，北京中杉金橋公司）；PVDF膜（美國Millipore公司）；ECL發光試劑盒（美國Pierce公司），CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司）。

1.2 方法

1.2.1 p53RFP表達載體的構建及鑒定：37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養SW620細胞48 h，用RNAiso Plus試劑提取細胞總RNA。逆轉錄合成cDNA。根據p53RFP基因CDS區序列設計引物，引入限制性內切酶HindⅢ和EcoRⅠ的識別位點，上游引物：5′CATCTGGACCCCTACCGAACA3′，下游引物：5′ACACGAGCAGAATTTCAGGTG3′。PCR 擴增p53RFP編碼序列，反應體系為50 μL：10×PCR緩沖液 5 μL，dNTP 5 μL，Mg2+3 μL，上下游引物（10 μmol）各 1.5 μL，cDNA 模板 2 μL，KOD-Plus-Neo 1 μL。PCR 反應條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，55 ℃30 s，68℃1 min 20 s，共32個循環；68℃延伸 3 min。取PCR純化產物和pcDNA4/Myc-HisA質粒分別行HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切，回收大片段，加T4連接酶16℃水浴過夜。連接產物轉化感受態DH5a，將轉化產物均勻涂布于含有100 mg/L氨芐青霉素的LB選擇平板上倒置培養過夜。篩選2～3個菌落，搖菌后取1 μL進行PCR擴增鑒定；小量提取質粒DNA，進行HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，將雙酶切鑒定正確的質粒送英駿公司測序。

1.2.2 p53RFP表達載體轉染HEK293A細胞：以含5%胎牛血清的DMEM培養基培養HEK 293A細胞，轉染前1 d細胞傳代。將5×105細胞接種于6 cm培養皿，使轉染時細胞匯合率在80%以上。以Opti-MEM 250 μL分別稀釋 pcDNA4-p53RFP質粒約 5 μg和 10 μL LipofectamineTM2000。轉染 4 h 后更換新鮮培養基。

1.2.3 RT-qPCR檢測轉染后p53RFPmRNA表達水平：pcDNA4-p53RFP轉染HEK293A細胞24 h，提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板行PCR，反應條件：95 °C 10 min；95 °C 10 s，60 °C，30 s，40個循環。引物序列如下：p53RFP：上游引物5′CATCTGGACCCCTACCGAACA3′，下游引物 5′ACA CGAGCAGAATTTCAGGTG3′；β-actin：上游引物 5′CAAATGCTTCTAGGCGGACTATG3′，下游引物 5′TGCGCAAGTTAGGTTTTGTCA3′。

1.2.4 Western blot檢測轉染后p53RFP蛋白表達水平：pcDNA4-p53RFP轉染HEK293A細胞48 h，提取細胞總蛋白。將蛋白加入6×loading buffer，100°C煮沸5 min。取30 μg總蛋白上樣，行12%SDS-PAGE電泳，200 mA 70 min轉印至PVDF膜，依次5%脫脂牛奶封閉，一抗（p53RFP 1︰600稀釋，β-actin 1︰1 000稀釋）孵育過夜，TBST漂洗（10 min×3次），二抗（1︰10 000稀釋）室溫孵育1 h，TBST漂洗（10 min×3次），ECL發光。

1.2.5 細胞增殖活力檢測（cell couning kit-8，CCK-8）p53RFP過表達對HEK293A細胞增殖的影響：接種 HEK293A 細胞于 6孔板（3×105～4×105/孔），24 h后轉染pcDNA4-p53RFP，空載體轉染組做陰性對照，空白組不做任何處理。轉染4 h后更換為新鮮培養基。12 h后消化為單細胞懸液，以每孔2 000個細胞接種于96孔板，每組6個復孔。于轉染后24 h、48 h、72 h 及 96 h，向培養孔加入 10 μL CCK-8 溶液，在培養箱中孵育3 h，用酶標儀檢測450 nm的吸光度值。

1.3 統計學分析

應用SPSS 13.0統計軟件，采用One-way ANOVA檢驗比較不同處理組p53RFPmRNA表達水平，及不同處理組對HEK293A細胞增殖水平是否具有統計學差異。當方差分析差異有統計學意義，且方差齊性時，采用LSD法行多重比較，方差不齊時采用Games-Howell檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 p53RFP基因克隆

所要擴增的p53RFP基因的長度為912 bp，RTPCR的擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳顯示，條帶大小與理論值一致，表明成功擴增出p53RFP基因。見圖1。

2.2 pcDNA4-p53RFP質粒酶切及測序鑒定

pcDNA4-p53RFP質粒經HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切后，取5 μL酶切產物行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖2所示：可見載體片段（5.1 kb）和目的片段（912 bp），表明載體連接成功。

2.3 RT-qPCR檢測p53RFPmRNA表達

RT-qPCR檢測結果顯示：pcDNA4-p53RFP轉染組p53RFPmRNA相對表達量（34739.440±1382.572）顯著高于空白組（0.980±0.020）及空載體轉染組（0.837±0.101）（P 均<0.01），表明 pcDNA4-p53RFP轉染HEK293A后可在細胞內高表達。

2.4 Western blot檢測p53RFP蛋白表達

Western blot結果如圖3所示：pcDNA4-p53RFP轉染組p53RFP蛋白表達水平上調，提示pcDNA4-p53RFP轉染HEK293A細胞可大量表達p53RFP蛋白。

2.5 轉染后各組細胞增殖水平

CCK-8檢測結果如圖4所示：與陰性對照組相比，pcDNA4-p53RFP轉染組轉染后72 h、96 h細胞增殖受到明顯抑制（P均<0.01）。

3 討論

p53RFP是新近發現的調控細胞增殖和細胞周期的重要基因［1］，目前對該基因的研究較少。對其生物學活性的認識主要停留在它作為p53下游靶基因參與的細胞凋亡過程方面。為研究p53RFP的生物學功能，本研究成功構建了p53RFP的表達載體，并將其轉染至HEK293A細胞。結果發現：轉染后，p53RFP可在HEK293A細胞高效表達，并可抑制HEK293A細胞的增殖。據文獻報道，p53RFP作為p53誘導的泛素連接酶，可能通過泛素化降解凋亡的重要啟動信號p21WAF1參與細胞周期的調節［1］。而p53RFP是否可以直接調控細胞周期蛋白，從而影響細胞增殖，尚有待于進一步研究。

泛素—蛋白酶系統在生理及病理生理條件下可發揮多種重要作用。真核細胞內約80%的蛋白都是通過泛素—蛋白酶系統降解。E3泛素連接酶是泛素—蛋白酶系統特異性的重要成分，決定泛素介導的蛋白酶體降解途徑底物的特異性［4］。大多數E3泛素連接酶屬于RING結構域家族，其最典型的特點是具有環指結構域，該結構是此家族具有泛素連接酶作用的重要因素。具有環指結構域的E3泛素連接酶參與調節很多重要的細胞功能，如細胞周期、DNA修復、細胞信號轉導及對低氧的反應［5～9］。p53RFP包含氮端的RING-IBR-RING結構域和碳端保守結構域，研究發現氮端的RING-IBR-RING結構域決定其產物具有E3泛素連接酶活性，碳端的保守結構域也可能具有重要的功能［3］。目前，對于p53RFP基因的功能研究較少，p53RFP的功能及其作用機制尚待進一步闡明。因此，本研究構建的p53RFP表達載體為進一步研究p53RFP的生物學功能奠定了基礎。

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