PIK3CB、Akt及p-Akt在子宮內膜癌中的表達及意義

張琛，楊清，王玉

（中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科，沈陽 110004）

子宮內膜癌作為發病率最高的女性盆腔生殖道惡性腫瘤之一，嚴重影響女性健康。許多信號轉導途徑與子宮內膜癌的發生、發展過程關系密切，其中磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信號轉導途徑作為最主要的信號轉導途徑之一，在腫瘤細胞增殖、凋亡及侵襲中發揮著重要作用。本實驗采用免疫組化方法及Western blot檢測PIK3CB、Akt及p-Akt在子宮內膜癌組織中的表達情況，探討子宮內膜癌的發病機制，為子宮內膜癌的診治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

材料來源于中國醫科大學附屬盛京醫院2005年1月至2007年12月婦科手術治療的患者。免疫組化實驗采用蠟塊標本58例，其中增殖期子宮內膜6例，子宮內膜非典型增生7例，子宮內膜樣腺癌45例；病理分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期14例，Ⅲ期10例；組織學分級：高分化（G1）15 例，中分化（G2）20 例，低分化（G3）10例。Western blot采用新鮮標本 30例，均為手術時取材，取材后立即送-70℃冰箱保存，其中增殖期子宮內膜6例，子宮內膜非典型增生6例，子宮內膜樣腺癌18例。增殖期子宮內膜、子宮內膜非典型增生及子宮內膜樣腺癌均經病理學診斷證實，其中子宮內膜樣腺癌根據世界衛生組織/國際婦產科聯盟手術病理分期標準進行分期，患者術前均未接受過放療、化療或激素治療。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學檢測：PIK3CB抗體購于美國Abcam公司，Akt、p-Akt抗體及SP試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司，SP免疫組化染色按試劑盒說明操作。免疫組化結果判定：PIK3CB、Akt及p-Akt陽性細胞染色均為棕黃色顆粒，定位于細胞質。采用MetaMorph/DP10/BX41顯微圖像分析系統分析結果。以積分光密度（integral optical density，IOD）代表蛋白顆粒密度。

1.2.2 Western blot檢測：取40 μg總蛋白上樣進行10%不連續SDS-PAGE電泳，通過電轉移法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉印至硝酸纖維素濾膜上，10%脫脂奶粉于室溫封閉濾膜過夜，常規將轉印后的膜依次與一抗和二抗孵育，最后以堿性磷酸酶法顯色目的條帶。Western blot結果判定：應用自動電泳凝膠成像分析儀（Alpha Innotech Corporation 5500型，美國Alpha Innotech公司）分析蛋白條帶的強弱（以IOD表示）。

1.3統計學分析

2 結果

2.1 免疫組織化學檢測結果

免疫組化結果顯示PIK3CB、Akt及p-Akt均主要在胞質內表達，顯微鏡下表達陽性細胞可見胞質呈棕黃色（圖1）。在增殖期子宮內膜組織中，PIK3CB、Akt及p-Akt呈弱陽性表達或陰性表達，在子宮內膜非典型增生組織及子宮內膜樣腺癌組織中的表達明顯增高（P<0.05），見表1。值得注意是，在不同臨床病理分期和不同組織類型病理分級的子宮內膜樣腺癌組織中PIK3CB表達量的差異無統計學意義（P>0.05）；在不同組織類型病理學分級的子宮內膜樣腺癌組織中，Akt及p-Akt的表達量差異具有統計學意義（P<0.05），但與臨床病理分期無關（P>0.05），見表 2。

表1 PI K3C B、Akt及p-Akt在不同子宮內膜組織中表達的I O D值Tab.1 I nt egralopt i caldensi t y val ues ofPI K3C B，Aktand p-Akti n di f f erentendom et ri alt i ssues Group n PIK3CB Akt p-Akt Normal proliferative-phase endometrium 6 1.51±0.84 10.57±2.45 15.60±1.65 Atypical endometrial hyperplasia 7 9.96±13.151） 15.06±3.151） 32.89±5.401）Endometrial carcinoma 45 27.81±15.421），2） 38.59±2.871），2） 66.51±6.981），2）1）P<0.05 vs normal proliferative-phase endometrium；2）P<0.05 vs atypical endometrial hyperplasia.

2.2 Western blot檢測結果

Western blot定量分析 PIK3CB、Akt及 p-Akt的表達量，結果與免疫組化實驗的結果一致，在不同類型的子宮內膜組織中PIK3CB、Akt及p-Akt蛋白的表達量差異具有統計學意義（P<0.05），由增殖期子宮內膜到子宮內膜非典型增生到子宮內膜樣腺癌呈增強趨勢。

表2 PI K3C B、Akt及p-Akt在不同組織學分級和病理分期子宮內膜樣腺癌組織中表達的I O D值Tab.2 I nt egralopt i caldensi t y val ues ofPI K3C B，Aktand p-Akti n di f f erentt ypes ofendom et ri aladenocarci nom a t i ssues by hi st ol ogi calgrade and pat hol ogi calst age Item n PIK3CB Akt p-Akt Histological grade G1 15 25.28±4.98 29.52±4.25 7.33±2.37 G2 20 28.44±3.40 38.84±3.02 12.18±1.43 G3 10 30.36±2.78 51.70±8.22 25.67±2.80 Pathological stageⅠ21 25.63±2.36 34.90±2.88 9.28±2.86Ⅱ14 25.01±1.50 48.90±2.26 12.05±3.07Ⅲ10 36.44±2.30 50.27±8.40 17.48±1.95

3 討論

PI3K/Akt信號轉導通路與子宮內膜癌的發生發展密切相關，催化亞基PIK3CB作為Ⅰ型PI3K的重要組成部分，在腫瘤的形成和發展中發揮著重要作用：（1）抑制細胞凋亡，促進細胞增殖［1，2］。（2）介導細胞周期進展、促進細胞增殖：PIK3CB可以通過對周期素依賴性激酶的調節作用，促進細胞周期的運行。Cyclin E是屬于G期細胞周期的正調節因子，PIK3CB的下調可以導致Cyclin E顯著下降，從而影響細胞周期的進展［3］。（3）PIK3CB可以誘導致癌性轉化：多項研究表明，PIK3CB的高表達有潛在的誘導致癌性轉化作用［4，5］。這可能是因為PIK3CB過表達導致的PI3K/Akt信號轉導途徑的過度激活，促進腫瘤細胞的增殖。此外，PIK3CB不僅通過抑制細胞凋亡、促進細胞增殖而與腫瘤發生有關，還可影響腫瘤細胞的遷移、侵襲而促進腫瘤進展［6］。本研究發現，PIK3CB主要在細胞胞質表達，在子宮內膜樣腺癌組織中的表達量明顯高于增殖期子宮內膜組織和子宮內膜非典型增生組織（P<0.05），Western blot結果與免疫組化結果一致。由此可見，PIK3CB可能通過抑制子宮內膜細胞正常凋亡而在子宮內膜癌的發生、發展過程中發揮重要作用。Wee等［5］通過對前列腺癌PC3細胞系、人惡性膠質瘤U87MG細胞系的研究表明，抑制PIK3CB的表達可以有效的下調p-Akt的表達，抑制PC3細胞及U87MG細胞的增殖，并促進其細胞凋亡，降低了腫瘤細胞的惡性生物學行為，在抑制腫瘤的發生、發展中具有重要作用。在針對乳腺管癌［7，8］的研究中亦表明，敲除PIK3CB基因能有效地抑制了乳腺管癌細胞的增殖，促進其凋亡。進一步說明針對PIK3CB的干預治療有可能成為抑制腫瘤增殖和存活的一個新的治療方法，亦有可能成為子宮內膜癌治療的一個新靶點。

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可抑制腫瘤細胞的凋亡，促進腫瘤細胞增殖：（1）Akt的活化可受大量細胞因子、生長因子的觸發，從而保護細胞免受凋亡。（2）過表達顯性失活突變Akt基因可促進凋亡，而過表達組成性激活突變Akt基因可抑制凋亡。Akt參與了多種惡性腫瘤的發生、發展，在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌及胃癌中都檢測出了Akt的過表達［9］。有研究顯示Akt在胃癌組織中呈高表達，提示Akt蛋白的高表達可能促進胃癌細胞的增殖，抑制其凋亡。我們發現Akt在子宮內膜樣腺癌組織中亦呈高表達，表達量明顯高于增殖期子宮內膜組織和子宮內膜非典型增生組織（P<0.05），提示Akt的過表達可能促使子宮內膜細胞逃避凋亡、異常增殖并促進子宮內膜癌的發生和發展。

p-Akt作為Akt的活化形式，在抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤細胞增殖和血管生成等方面發揮著重要作用。大量研究表明，在許多惡性腫瘤中p-Akt呈持續高度活化，而且p-Akt的異常表達與腫瘤的發生、發展以及對放化療產生的耐受密切相關［10］。通過我們的研究證實p-Akt在子宮內膜樣腺癌組織中的表達明顯高于增殖期子宮內膜及子宮內膜非典型增生組織（P<0.05），表明Akt的磷酸化激活可能是促進子宮內膜癌細胞增殖、抑制其凋亡的重要原因。Aleskandarany等［11］對大宗病例的檢測結果顯示，76%的早期乳腺浸潤性導管癌中p-Akt呈高表達。同樣，對結直腸癌的研究提示p-Akt的表達與結直腸癌的TNM分期相關，推測p-Akt很可能在結直腸癌的生長和發展過程中發揮重要作用，其高表達促進淋巴結轉移的發生。在本研究中還發現PIK3CB、Akt及p-Akt在子宮內膜樣腺癌組織中的表達量均明顯高于增殖期子宮內膜組織及子宮內膜非典型增生組織（P<0.05），由此推測在子宮內膜癌中，PIK3CB的過表達能夠上調Akt及p-Akt的表達，促進子宮內膜癌細胞的增殖，抑制其凋亡，但三者之間的關系具體如何，還需進一步的研究證明。

綜上所述，深入研究PI3K/Akt信號轉導通路在子宮內膜癌發生、發展中的作用，不僅有利于闡明子宮內膜癌惡性增殖和存活的分子機制以及加深對PI3K/Akt信號轉導通路的了解，還能為臨床預測子宮內膜癌的發生、基因治療和預后判斷提供新的有效靶點。

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