痛瀉要方對內臟高敏感大鼠結腸黏膜蛋白質表達譜的影響

丁 鶯 呂 賓 孟立娜 范一宏 沈 雁

杭州市下沙醫院急診科1(310018) 浙江中醫藥大學附屬第一醫院消化內科2

腸易激綜合征(IBS)是一種常見的胃腸功能紊亂性疾病，西方國家人群的患病率高達10% ～20%［1］;我國城市居民患病率為 10.50%，鄉村為6.14%［2］。一項韓國研究［3］顯示IBS相關癥狀可對患者的健康相關生活質量(HRQOL)產生重大影響，對社會造成沉重的經濟負擔。IBS的發病機制目前尚未完全闡明，可能與腸道動力、分泌、感覺等異常相關［4］。蛋白質組學能從組織臟器整體水平上動態定量地觀察疾病過程中蛋白質的改變，有助于探尋疾病的發病機制。本研究運用蛋白質組學技術觀察痛瀉要方對內臟高敏感大鼠結腸黏膜蛋白質表達譜的影響，旨在從分子水平探討痛瀉要方對IBS起效的可能作用機制。

材料與方法

一、主要材料

1.實驗動物:清潔級成年雌性Sprague－Dawley(SD)大鼠24只，體質量約200 g，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號:SYXK(浙)2008－003。于室溫22～24℃、濕度 ＜60%、噪音 ＜50 dB的環境中分籠飼養，正常飲水攝食。

2.痛瀉要方煎劑制備:按成人體質量60 kg，痛瀉要方包括炒白術15 g、炒白芍12 g、防風10 g、陳皮6 g。大鼠用藥量以成人單位體質量的6.25倍計算。取生藥顆粒劑，以蒸餾水作為溶劑，充分攪拌使其溶解，配置生藥濃度1 g/mL，40℃避光保存，置于避光飲水瓶中。按生藥4.5 g·kg－1·d－1，即痛瀉要方煎劑4.5 mL·kg－1·d－1給藥，由浙江中醫藥大學附屬第一醫院制劑室提供。

3.主要試劑:考馬斯亮藍 R－250、二硫蘇糖醇(DTT)、尿素、瓊脂糖、甘油、溴酚藍、3－(3－膽酰胺丙基)二甲氨基－1－丙磺酸(CHAPC)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、碘乙酰胺(IAA)、固相pH梯度(IPG)膠條(pH 3～10)和Bradford蛋白定量試劑盒購自美國Bio－Rad公司;硫脲購自美國Fluka公司;通用蛋白酶抑制劑混合物(PIC)購自瑞士Roche公司;CyDye熒光染料試劑盒購自美國GE Healthcare公司;賴氨酸購自美國Amresco公司;Milli－Q水購自于美國Millipore公司;兔抗鼠/人二硫鍵異構酶結合蛋白(PDIA3)多克隆抗體購自英國Abcam公司;羊抗兔多克隆抗體和化學發光試劑購自北京康為世紀生物科技有限公司。細胞裂解液自行配制，內含Tris 30 mmol/L、硫脲 2 mol/L、4%CHAPC，以 HCl調整pH值為8.5。重泡漲液自行配制，內含尿素7 mol/L、硫脲 2 mol/L、4%CHAPS、1%IPG 緩沖液、DTT 40 mmol/L、痕量溴酚藍。膠條平衡液自行配制，內含尿素180 g、十二烷基硫酸鈉(SDS)10 g、TrisCl(pH 8.8)16.75 mL、甘油 150 mL，以 Milli－Q水定容至500 mL。

4.主要儀器:Ettan IPGphorⅡ型等電聚焦儀和Ettan DALTsix大規模垂直電泳系統購自美國GE Healthcare公司;Typhoon 9410多功能激光掃描成像系統、全自動斑點切取系統Ettan Spot Picker和自動質譜點樣系統 Ettan Spotter購自美國 Amersham Biosciences公司;基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀(4800 Plus MALDI TOF/TOF質譜儀)購自美國ABI公司;400R型臺式低溫高速離心機購自德國Heraeus公司。

二、方法

1.動物分組和造模方法:24只大鼠順序編號，按隨機數字表法分為3組:空白對照組、模型對照組和治療組，每組各8只。空白對照組大鼠在正常條件下飼養，后兩組參照晁冠群等［5］的方法，以樟腦丸特殊氣味作為條件刺激，結直腸擴張結合經典的肢體束縛作為非條件刺激，建立內臟高敏感模型。將大鼠裝入放有樟腦丸的應激籠，用膠布固定四肢和軀干45 min，限制自由運動，但可作少許前后活動和回頭。固定后將氣囊導管經肛門插入直腸，氣囊遠端距肛門口約1 cm，并固定于鼠尾。氣囊內壓力＞60 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，以間斷充氣法行結直腸擴張，每次充氣1.6 mL，持續60 s，以3 min的間隔重復充氣10次，完成1次應激程序。第1 d完成1次應激程序后放回原飼養環境，第2 d同一時間給予同樣應激程序1次，第4 d給予條件刺激45 min，第5 d重復應激程序，第6、8 d給予條件刺激45 min，第3、7 d正常喂養。模型制備成功后，各組給予不同的藥物干預。空白對照組和模型對照組大鼠均以 0.9%NaCl溶液 4.5 mL·kg－1·d－1灌胃，治療組以痛瀉要方煎劑 4.5 mL·kg－1·d－1灌胃，連續4周。

2.模型驗證方法:實驗第14 d，將石蠟油潤滑后的8F導尿管經肛門插入，將球囊末端置于距離肛門1.0 cm處，用棉線將導尿管固定于大鼠尾巴根部。待大鼠適應環境后，逐漸注水使球囊擴張，行大鼠腹壁回撤反射(AWR)評分。AWR評分標準:0分，大鼠對結直腸擴張無行為學反應;1分，結直腸擴張時身體靜止不動，頭部運動減少;2分，結直腸擴張時腹肌收縮，但腹部未抬離桌面;3分，結直腸擴張時腹肌收縮并抬離桌面;4分，結直腸擴張時骨盆抬起，身體呈弓形。記錄AWR評分為3分時所需的注水量。每次結直腸擴張持續30 s，重復進行3次，取均值。

3.干預后內臟敏感性評估:實驗第43 d，對各組動物行直腸注水擴張實驗，采用AWR評分評估大鼠內臟敏感性，具體操作方法同前。

4.大鼠結腸黏膜組織蛋白質樣品的制備:實驗第45 d，大鼠腹腔注射10%水合氯醛深麻醉處死，取距回盲部約2 cm的結腸1塊，按100 mg樣品加300 μL組織裂解液的比例加入裂解液，同時加入1%核酸酶和1%PIC，混勻、勻漿，研磨時避免產生泡沫。然后室溫變性作用60 min。4℃ 20 627×g離心30 min，收集上清液，應用Bradford法測定每份蛋白質樣品濃度，分裝后－80℃凍存備用。

5.蛋白質樣品的熒光標記:將空白對照組、模型對照組和治療組樣品pH值調至8.5。避光條件下50 μg空白對照組樣品(5 ～ 10 μL)加入 1 μL(400 pmol)CyDye Cy3，50 μg 模型對照組樣品加入1 μL(400 pmol)CyDye Cy5，再各取兩組樣品 25 μg加入1 μL(400 pmol)CyDye Cy2(作為內標1)。另取兩組樣品進行反標，即空白對照組樣品中加入CyDye Cy5、模型對照組樣品中加入CyDye Cy3，樣品和熒光染料用量以及內標1設置同上。

避光條件下50 μg模型對照組樣品(5～10 μL)加入 1 μL(400 pmol)CyDye Cy3，50 μg 治療組樣品加入1 μL(400 pmol)CyDye Cy5，再各取兩組樣品25 μg 加入 1 μL(400 pmol)CyDye Cy2(作為內標2)。另取兩組樣品進行反標，即模型對照組樣品中加入CyDye Cy5、治療組樣品中加入CyDye Cy3，樣品和熒光染料用量以及內標2設置同上。

避光冰浴30 min后，加入10 mmol/L賴氨酸1 μL終止反應。

6.差異蛋白質篩選:采用熒光差異雙向凝膠電泳法(2D DIGE)。將3種熒光染料標記的蛋白混合，重泡漲液定容至450 μL。20℃條件下采用Ettan IPGphorⅡ等電聚焦儀將24 cm IPG膠條水化重泡漲6 h，以設定程序進行第一向固相pH梯度等電聚焦(IEF)，總電壓時間為80 000 V·h。然后將膠條分別放置在含2%DTT和4%IAA膠的平衡液中各振蕩平衡15 min，再移至12.5%的SDS－聚丙稀酰胺凝膠電泳(PAGE)均一膠上，行第二向SDSPAGE電泳。置于Ettan DALTsix大規模垂直電泳儀中20℃、40 mA恒電流電泳，直至溴酚藍到達膠的底端。Typhoon 9410多功能激光掃描成像系統掃描雙向電泳凝膠，Cy2的激發光和發射光波長分別為480、530 nm，Cy3分別為540、590 nm，Cy5 分別為620、680 nm。掃描后采用DeCyder 5.0軟件(美國Amersham Bioscience公司)分析圖像文件，挑選出空白對照組與模型對照組、模型對照組與和治療組之間蛋白表達量比值絕對值≥1.4的差異蛋白點。

7.差異蛋白質鑒定:采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法(MALDI－TOF MS)。取空白對照組和模型對照組蛋白樣品各500 μg以及模型對照組和治療組樣品各500 μg，按常規方法行雙向電泳后，考馬斯亮藍染色，采用Ettan Spot Picker全自動斑點切取系統機械手臂挖取與明顯差異表達蛋白點相匹配的蛋白點。50%乙腈沖洗、胰蛋白酶消化、自動質譜點樣系統Ettan Spotter行蛋白樣品點樣后，應用4800 Plus MALDI TOF/TOF質譜儀進行檢測，獲取含有序列信息的二級質譜圖，應用MASCOT軟件在國際蛋白質索引(international protein index，IPI)數據庫中進行蛋白質匹配，獲取應用MALDITOF－MS/MS技術鑒定差異蛋白質的得分。當某個蛋白質的得分＞60時，可以認為鑒定成功。應用Gene Ontology軟件對這些差異蛋白質進行功能和亞細胞定位分類。

三、統計學分析

結 果

一、模型驗證

AWR評分為3分時，造模大鼠(包括模型對照組和治療組大鼠)和空白對照組所需的注水量分別為(0.90±0.12)mL和(1.49±0.18)mL，造模大鼠的內臟敏感性明顯高于空白對照組(P＜0.01)，表明造模成功。

二、痛瀉要方對大鼠內臟敏感性的影響

AWR評分為3分時，模型對照組大鼠所需的直腸注水量明顯低于空白對照組［(0.90±0.16)mL對(1.63±0.17)mL］，差異有統計學意義(P＜0.01)，提示模型對照組大鼠內臟敏感性明顯增高。給予痛瀉要方治療后，治療組注水量明顯高于模型對照組［(1.23±0.10)mL對(0.90±0.16)mL］，差異有統計學意義(P＜0.01)，提示治療組內臟敏感性較模型對照組明顯降低。

三、差異蛋白質篩選

經DeCyder 6.5軟件分析，治療組和模型對照組大鼠結腸黏膜組織樣品中共有1278個蛋白匹配點，其中差異表達蛋白點61個，23個蛋白點在治療組的表達明顯上調，38個蛋白點在治療組明顯下調(見圖1)。

四、差異蛋白質鑒定

從61個差異蛋白點中人工篩選出5個差異表達明顯的蛋白點進行質譜分析。經IPI數據庫檢索，鑒定出3個特異蛋白質(見表1)，治療組大鼠結腸黏膜組織中表達上調的蛋白質為Transgelin(TAGLN)蛋白和乙醛脫氫酶2(Aldh2)，表達下調的蛋白質為角蛋白8(CK8)。

圖1 治療組和模型對照組大鼠結腸黏膜組織蛋白樣品的熒光差異雙向凝膠電泳圖

表1 治療組和模型對照組大鼠結腸黏膜組織間差異蛋白質鑒定結果

討 論

痛瀉要方源自《景岳全書》，具有補脾柔肝、祛濕止瀉之功效，長期臨床觀察證實其對腹痛、腹瀉療效顯著。IBS發病的病理基礎為肝郁脾虛，病機主要在于肝脾氣機不暢，運化失常，大腸傳導失司，日久及腎，形成肝、脾、腎、腸胃諸臟功能失調。憂思惱怒，久郁不解，傷及于肝，肝氣不疏，橫逆及脾，脾氣失和，可形成肝脾不調證。痛瀉要方所治痛瀉，是由脾虛肝旺、肝氣乘脾、升降失常而致，所謂“土虛木賊”之證，即肝郁脾虛證。痛瀉要方由白術、陳皮、白芍、防風中藥組成，其中白術燥濕健脾，白芍養血瀉肝，陳皮理氣醒脾，防風散肝舒脾。諸藥合用，可補脾土而瀉肝木，調氣機以止痛瀉。結合痛瀉要方對IBS有疏肝健脾、益氣和胃的功效［6］。

本研究以痛瀉要方治療4周后，治療組大鼠內臟敏感性明顯降低(P＜0.01)，說明補脾柔肝法對調節內臟高敏感具有一定的作用。以藥測證，由此推測大鼠內臟敏感性的形成機制主要為肝郁脾虛。任何形式的應激首先影響機體正常氣機，肝主疏泄可調節全身氣機，因此肝臟可能是機體調節應激的核心，肝主疏泄功能對機體應激具有重要的調節作用［7］。IBS腹痛、腹部不適與內臟高敏感高度相關，而IBS腹痛、腹部不適反復發作多與心理因素有關，如著急或生氣時易發作，說明氣機郁滯可能是內臟敏感性增高的主要原因之一，運用痛瀉要方能明顯調節內臟高敏感大鼠的內臟敏感性。

TAGLN是具有轉型變異和形狀改變敏感性的肌動蛋白凝膠蛋白，由 Lees－Miller等［8］在雞平滑肌中首先發現。TAGLN蛋白在平滑肌中表達較高，可能與細胞分化和細胞骨架重排有關。程云會等［9］的研究結果表明，TAGLN基因參與血管平滑肌細胞的細胞骨架構成以及調節細胞收縮功能，對維持血管平滑肌細胞處于收縮表型具有重要作用。Aldh2催化乙醛脫氫生成乙酸，后者進入三羧酸循環，代謝為CO2和H2O，是乙醇代謝的關鍵酶之一。本研究發現給予痛瀉要方治療后，TAGLN蛋白和Aldh2表達均較模型對照組明顯上調，但其與內臟敏感性的相關性有待進一步研究。

上皮細胞內含有20種CK，CK8在維持胃腸道上皮結構和功能方面起重要作用。CK8缺失小鼠可發生慢性結腸炎［10］和水電解質轉運紊亂［11］，為細菌移位致病創造條件。CK8突變可引起人腸道上皮細胞抵抗力降低，可能在炎癥性腸病的發生中扮演重要角色［12］。有文獻報道IBS患者存在腸道部分菌群失調以及黏膜低度炎癥［13］。CK8表達增加可能在腸道黏膜上皮抗促炎刺激物中發揮作用。本課題組的前期研究［14］顯示內臟高敏感大鼠結腸黏膜組織中CK8表達增加，提示結腸黏膜存在低度炎癥反應，可能引起內臟敏感性增高。本研究給予痛瀉要方治療后，大鼠結腸黏膜CK8蛋白表達較模型對照組下調，內臟敏感性亦明顯降低，提示痛瀉要方可下調炎癥相關蛋白的表達，這可能是其降低大鼠內臟敏感性的機制之一。但IBS的發生機制復雜，包括腸道免疫、炎癥、神經內分泌網絡調控變化等。針對目前已鑒定出來的2個上調蛋白和1個下調蛋白在IBS發生和治療中的作用，尚需進一步研究加以證實。

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