HPV DNA檢測診斷宮頸癌前病變的意義

智艷芳 李肖甫 李雁青 榮守華

HPV DNA檢測診斷宮頸癌前病變的意義

智艷芳 李肖甫 李雁青 榮守華

目的 檢測宮頸脫落細胞中HPV DNA進而診斷宮頸癌前病變，提高診斷率。方法 選取300例宮頸脫落細胞液用雜交捕獲II代法（HC2法）檢測HPV DNA感染情況，并用TCT法檢測細胞病變情況。結果 300例樣本中，細胞學陰性（NILM）127例（42.33%），ASCUS 95例（31.67%），ASC-H 16例（5.33%），LSIL 46例（15.33%），HSIL16例（5.33%）。所對應HPV感染率分別為依次為35.43%、61.05%、75.00%、78.26%和87.50%。同時31～50歲年齡段感染率高于其他年齡段(P＜0.05)。結論 HPV感染與宮頸癌前病變關系密切，隨宮頸病變程度的增加而顯著增加（HSIL＞LSIL＞ASC-H＞ASCUS＞NILM）。

人乳頭瘤病毒；宮頸腫瘤；癌前病變；細胞診斷學

人乳頭瘤病毒(hum anpapillom avirus,HPV)是最常見的性傳播感染病原體之一，是導致宮頸癌發生的主要原因。因此，許多學者提出應當將檢測HPV感染作為宮頸癌的一種篩查手段，以期在初篩中濃縮高風險人群[1-2]。本文通過二代雜交捕獲技術（HC2）檢測高危型HPV在宮頸癌前病變不同時期的感染情況，探討HPV檢測在宮頸癌前病變中的意義，為宮頸癌的防治提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床標本來源及采集 采集2010年1月～2011年1月鄭州大學第三附屬醫院門診就診的已婚或有性生活史的女性患者樣本300份。分別采用TCT公司和美國Digene公司的一次性取樣器，刷取宮頸外口和頸管脫落細胞進行TCT和HPV檢測。患者年齡19～76歲，平均37.11歲。無子宮切除和相關宮頸手術史, 無盆腔放射治療史。

1.2 人乳頭瘤病毒檢測 采用美國Digene公司提供的試劑盒，通過基因雜交捕獲技術檢測高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)。工作原理：樣本在堿性條件下加熱水解，使DNA雙鏈變為單鏈；試劑盒提供全長8000個堿基對的RNA混合探針，通過堿基配對的原理又重新組成RNA 2DNA雙鏈雜合體(雜交)。雜交后的樣本加到有單克隆抗體的96孔捕獲板中，該抗體捕獲雜交的RNA 2DNA雙鏈雜合體。然后再與帶有單克隆抗體的化學發光劑相作用，通過光信號放大被記錄下來。

1.3 細胞學診斷 刷取的宮頸脫落細胞液經Th inp rep 2000系統自動制片機處理后，制成直徑2cm薄層細胞涂片(TCT)，然后固定、染色。采用TBS(the Bethesda system)分級系統。分為未見癌細胞/癌前病變細胞(正常+炎癥反應，NILM)、不明確診斷意義的非典型鱗狀上皮細胞(ASCUS)、未明確意義的非典型鱗狀上皮細胞不排除高度鱗狀上皮細胞內病變(ASC-H)、低度鱗狀上皮內病變(LSIL)和高度鱗狀上皮細胞內病變(HSIL)，共5組。

1.4 統計學方法 所有數據采用SPSS17.0統計軟件進行檢驗，數據采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

表1 不同年齡組HPV感染情況

2 結果

2.1 HPV檢出率與年齡的關系 300份樣本中HPV陽性169例（占56.33%），感染年齡（37.11±9.52）歲，其中17～20歲和61～76歲兩組的人數較少，其他各年齡組HPV感染率比較，31～50歲年齡段感染率總體高于其他年齡段(P＜0.05)，見表1。

2.2 宮頸脫落細胞學檢測結果 TCT鏡下檢查：NILM 127例，年齡（37.11±8.40）歲；ASCUS 95例，年齡（38.35± 10.70）歲；ASC-H 16例，年齡（42.31±8.30）歲；LSIL46例，年齡（35.26±9.93）歲；HSIL16例，年齡（39.12±8.55）歲。見表2。結果表明，HSIL組的發病年齡在40歲左右。

表2 各細胞學病變組年齡分布情況

2.3 HPV與TCT檢測結果比較 在300份樣本中HPV陽性169例，TCT發現細胞形態和結構改變173例。細胞學檢查細胞形態和結構未發現明顯改變（N ILM）的樣本中，HPV感染率為35.43%（45/127）；細胞形態和結構出現異常時HPV的檢出率不斷升高。在ASCUS和ASC-H組中，HPV感染率分別為61.05%（58/95）和75.00%(12/16)；LSIL組達78.26%(36/46)；HSIL組達87.50%(14/16)。檢驗：ASCUS和ASC-H兩組之間差異無統計學意義(χ2=1.144，P=0.285＞0.05)；N ILM組與其他組比較差異均有統計學意義(P＜0.01)。表明細胞形態和結構的異常與HPV感染密切相關，即HPV陽性檢出率HSIL＞LSIL＞ASC-H＞ASCUS＞NILM（見表3）。

表3 各組HPV感染情況

3 討論

3.1 檢測HPV感染的意義 目前HPV檢測廣泛用于HPV相關惡性病變的自然史和病因學研究。臨床上正在成為宮頸癌的另一種或是附加的篩檢方法。將HPV檢測用于宮頸癌檢查的基礎在于HPV感染與浸潤性宮頸癌和癌前病變密切相關。現有的流行病學資料顯示，大約80%的低度宮頸癌前病變的患者體內可以分離出HPV，高度宮頸癌前病變的患者中有90%可以分離出HPV，幾乎所有患浸潤性宮頸癌的婦女都能分離出HPV。一組特異性、稱為高危型HPV的持續感染，現在被公認為是宮頸癌的單一因素或是必要、聯合致癌因素。HPV DNA檢測檢查宮頸癌前病變的靈敏度（84%～100%）通常高于Pap涂片法，但特異性較低（64%～95%）。HPV檢測技術尤其是HC2法的出現為宮頸癌及癌前病變的診斷及病變進展的預測提供了準確的依據[3-4]。HC2檢測反映了高危型HPV感染與宮頸病變之間的關系。

3.2 HPV與年齡 在本研究的300例樣本中，HPV感染率為56.33%，31～50歲年齡段HPV感染率總趨勢略高于其他年齡段。脫落細胞正常HPV的感染率最低，為35.43%。HPV感染約2個月后機體產生抗體，依靠免疫能力8～10個月可使HPV感染由陽性轉變為陰性，但仍有10%～15%呈持續性感染狀態[5-6]。經過8～10年，宮頸上皮細胞發生不典型增生，導致不同程度的癌前病變，繼而癌變[3]。這里所說的HPV感染率是橫斷面感染率，橫斷0歲感染高峰也可能與中年階段更換性伴侶有關。考慮到我國較為保守的性觀念、性行為，筆者認為持續感染的增加或潛伏期HPV的再激活能更好地解釋本研究中31～50歲感染高峰。Castie等[7]也報道了在哥斯達黎加，45歲及以上女性人群的HPV感染更多是和病毒持續感染有關，而非新的HPV感染。鑒于圍絕經期高危型HPV陽性可能和病毒持續感染增加相關，高危型HPV篩查在圍絕經期女性中的臨床意義大于其在年輕婦女中的臨床意義。對于圍絕經期高危型HPV陽性的女性，進一步的細胞學檢查要優先予以推薦

3.3 TCT改善了制片技術 膜式液基薄層細胞學檢測系統是制片技術的重大革新。首先是解決了取材問題，液基取材采用固定樣式的掃帚式刷子按規定手法操作，旋轉式刷拭，取材具有代表性，刷頭全部進入細胞保存液，不會丟失細胞標本。保存液中的細胞經Thin PreP2000系統程序化處理后，黏液、血液、炎細胞與上皮細胞分離，經高精密過濾器過濾，再混合后制成的涂片均勻一致，為單細胞層。在涂片中的不正常細胞容易被觀察，并且濕固定的細胞核結構清晰，易于鑒別，降低了假陰性率，相對于其他檢查能及早發現異常細胞，是宮頸癌篩查的理想技術。在本組實驗中LSIL、HSIL兩組患者年齡＜40歲，這一佐證提示宮頸癌發生的年齡有逐漸年輕化的趨勢[8]。

3.4 HPV與細胞學的關系 在ASC-US和ASC-H兩組中有60%以上的患者感染HPV；LSIL組HPV感染占78.26%；HSIL組占87.50%。本文雖然缺少病理組織學的結果，但是隨著TBS的級別增高，HPV的感染率也出現升高的傾向。它們之間的關系是：HPV陽性檢出率HSIL＞LSIL＞ASC-H＞ASCUS＞NILM，這與文獻報道一致[9]。

宮頸癌早期發現和早期治療仍是當今治療的有效措施。治療上除手術切除腫瘤組織外，還應該切除HPV感染的組織，這一治療觀點已經被越來越多的學者接受，HPV的持續感染是治愈效果差和復發的重要原因。因此HPV檢測有利于宮頸癌及宮頸癌前病變的診斷，并可以對感染情況進行評價，即HPV陽性尚存在HSIL＞LSIL＞ASC-H＞ASCUS＞N ILM組的規律，若這一關系出現順序的倒錯，提示細胞病理學醫生在對宮頸病變診斷或分級可能存在偏差[10]。因此，HPV感染與否對宮頸疾病治療方法的選擇、治療效果的評價和隨訪都提供了有利的依據。

所以，將高危型HPV檢測作為篩查手段，可以比通常采用的宮頸細胞學檢測更有效地濃縮高風險人群，對臨床具有指導作用。例如細胞學陰性而高危型HPV陽性者，發病風險度較大，應密切定期隨訪。就如Cuzik等[11]所認為的那樣，應當將HPV置于子宮頸癌的病因鏈，使HPV檢測成為一種篩選子宮頸癌的手段，這必將有助于宮頸癌的預防。

[1] Tarkanen J, Auvinen E, Nieminen P, et a.l. HPV DNA testing as an adjunct in the management of patients with low grade cytological lesions in F inland[J]. ActaObstet Gyn ecol Scand, 2007,86: 367-372.

[2] Kalantari M,Chase DM,Tewari KS.et al.Recombination of human papillomavirus-16 and host DNA in exfoliated cervical cells: a pilot study of L1 gene methylation and chromosomal integration as biomarkers of carcinogenic progression[J]. J Med Virol,2010,82: 311-320.

[3] Herbert J.Coffin J. Reducing patient risk for human papillomavirus infection and cervical cancer[J]. J Am Osteopath Assoc,2008,108:65-70.

[4] Ord i J, Alonso I, Torne A, et al.Human papillomavirus load in Hybrid Capture II assay: does increasing the cutoff improve the test?[J]. Gynecol Onco,2005,99⑵: 313-319.

[5] Winer RL, Feng Q, Hughes JP, et al.Risk of female human papillomavirus acquisition associated with first male sex partner[J]. J Infect Dis,2008,197⑵:279-282.

[6] Althoff KN,Paul P,Burke AE,et al.Correlates of cervicovaginal human papillomavirus detection in perimenopausal women[J]. J Womens Health(L arehmt),2009,18⑼:1341-1346.

[7] Castle PE,Schiffman M,Herrero R,et al. A prospective study of age trends in cervical human papillomavirus acquisition and persistence in Guanacaste, Costa Rica[J].J Infect Dis 2005,191(11):1808-1816.

[8] Castle PE, Schiffman M, Herrero R, et al. Aprospective study of agetrendsin cervical human papillomavirus acquisition and persistence in guanacaste, costarica[J].Infect Dis,2005, 191(11):1808.

[9] Thomas D,Ray RM,Qin Q.et al.Risk factors for progression of squamous cell cervical carcinomain situto invasive cervical cancer: result of amultiple study[J]. Cancer Cause Contro,2002,13⑺:683.

[10] Bao YP, Li N, Smith JS.et al.Human papillomavirus typedistribution in the cervix of Chinese women: a meta-analysis[J]. Int J STD AIDS,2008,19: 106-111.

[11] Cuzik J. HPV testing in cervical screening[J]. JAMA, 2000,283⑴:108-109.

O bjective Human papilloma virus(HPV) DNA were detected to diagnose the precancerous cervical lesions and raise the diagnosis rate. Methods 300 specimens of cervical desquamated cells and secretion from cervical canal were tested w ith hybrid capture II (HC2 HPV DNA)and thinprep cytology(TCT)methods. Results Among 300 desquamated cervical cells specimens w ith TCT examination,127 specimens showed Negative for Intraepithelial Lesion or Malignancy（42.33%）,95 ASCUS（31.67%）,16 ASC-H（5.33%）, 46 LSIL （15.33%）and 16 HSIL（5.33%）. The positiverates of HPV however, were：61.50% of ASCUS, 75.00% of ASC-H, 78.26% of LSIL and 87.50% of HSIL, respectively. There was a slightly higher rate in age 31-50 groups, and the positive rate in NILM was 35.4%. Conclusion There was a high correlation (P＜0.01) between HPV infection and the abnormal cell morphology and cell construction. The Rate of positive HPV infection was obviously increased when abnormal cellular morphology and structure were found (HSIL＞LSIL＞ASC-H＞ASCUS＞NILM).

Human papillomavirus;Cervixneoplasms;Precancerous conditions;Cytodiagnosis

book=13,ebook=62

10.3969/j.issn.1009-4393.2012.26.008

450052 鄭州大學第三附屬醫院細胞室 （智艷芳 李肖甫 榮守華） 310009 浙江大學醫學院附屬第二醫院 （李雁青）