抑制Src酪氨酸激酶活性對人肺癌A549/DDP細胞耐藥性及MDR1和LRP表達的影響

律潔 田玉峰

腫瘤細胞產生耐藥性是臨床肺癌化療治療失敗的主要原因，克服腫瘤細胞多藥耐藥是癌癥治療中亟需解決的問題。腫瘤細胞產生耐藥性是一個復雜的過程，導致藥物在細胞內的蓄積減少或藥物靶部位的濃度降低，細胞抗凋亡能力的增強[1]。耐藥基因的激活與表達增加已被證實與腫瘤的耐藥性密切相關，其中多藥耐藥蛋白（multidrug resistance 1, MDR1）和肺耐藥相關蛋白（lung resistancerelated protein, LRP）是目前研究較多的耐藥機制，二者的表達與腫瘤細胞內或藥物靶部位藥物濃度有密切的關系。研究[2]證明，直接或間接地抑制MDR1和LRP的活性或表達可增加細胞內藥物的濃度從而逆轉腫瘤的耐藥性。

Src是一種分子量為60 kDa的酪氨酸激酶，是細胞蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinases, PTKs）中的膜相關Src家族激酶（Src family kinases, SFKs）成員，是最有代表性的非受體酪氨酸激酶之一[3]，在調控細胞的增殖、遷移和信號轉導等方面均發揮了重要作用[4]。大量研究[5]表明，Src酪氨酸激酶在多種腫瘤組織或細胞中呈現異常活化的現象，已經被證明與腫瘤細胞的生長、轉移、血管新生密切相關，是一個潛在的抗腫瘤藥物靶點。最近，Src酪氨酸激酶因被發現與腫瘤多藥耐藥密切相關而備受關注，研究[6]表明抑制Src酪氨酸激酶活性可逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥性，但是其機制還不完全清楚，正在引起人們的廣泛關注，值得深入研究。

1 對象與方法

1.1 主要試劑與儀器 人肺癌順鉑耐藥細胞A549/DDP購于中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，Src酪氨酸激酶抑制劑4-苯胺喹唑啉購自AstraZeneca公司，磷酸化Src單抗、MDR1和LRP單抗購自SantaCruz，Rh-123和CellTiter-Glo試劑盒購自Promega，逆轉錄試劑盒購自TaKaRa公司，流式細胞儀購自BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞與細胞培養 人肺癌順鉑耐藥細胞A549/DDP于5%CO2、37oC、飽和濕度的培養箱中培養傳代，以RPMI-1640培養基（含10%小牛血清）培養，0.25%胰酶-EDTA消化傳代，所有實驗均采用對數生長期細胞。

1.2.2 CellTiter-Glo發光法檢測Src酪氨酸激酶抑制劑對A549/DDP增殖的影響 取對數生長期的A549/DDP細胞，以5×104/mL接種到96孔微孔板中，每孔100 μL，37oC、5%CO2飽和濕度培養過夜使細胞貼壁。對應試驗孔加入濃度為0 μM、2.5 μM、10 μM、20 μM、50 μM、100 μM 4-苯胺喹唑啉，繼續培養72 h后，按照CellTiter-Glo試劑盒說明書檢測細胞活性，即將細胞裂解后，轉至遮光96孔板，加入ATP誘導化學反應試劑，混勻，10 min后用酶標儀檢測發光值。

1.2.3 CellTiter-Glo發光法檢測Src酪氨酸激酶抑制劑對A549/DDP細胞毒作用的影響 取對數生長期的A549/DDP細胞，以5×104/mL接種到96孔微孔板中，每孔100 μL，37oC、5%CO2飽和濕度培養過夜使細胞貼壁。對應試驗孔加入濃度為0 μM、2.5 μM、10 μM、20 μM、50 μM、100 μM順鉑，在此基礎上加入0 μM、2.5 μM或10 μM 4-苯胺喹唑啉，繼續培養72 h后，按照CellTiter-Glo試劑盒說明書檢測細胞活性。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞內Rh-123濃度的變化 取對數生長期的A549/DDP細胞，加入2.5 μM或10 μM 4-苯胺喹唑啉，不加入4-苯胺喹唑啉做對照，繼續培養24 h，加入10 μM Rh-123染液（10μL）繼續培養1 h。收集細胞，應用流式細胞儀檢測細胞中Rh-123的平均熒光強度，考察細胞中Rh-123的含量。

1.2.5 RT-PCR檢測MDR1和LRP的表達水平 取對數生長期的細胞，加入2.5 μM或10 μM Src酪氨酸激酶抑制劑4-苯胺喹唑啉，不加入4-苯胺喹唑啉做對照，培養24 h后，收集細胞，用Trizol法提取各組總RNA，用RT-PCR試劑盒進行逆轉錄得到cDNA，MDR1上游引物序列：5'-AAAAAGATCAACTCGTACCACTC-3'，下游引物序列：5'-GCACAAAATACACCAACAA-3'；LRP上游引物序列：5′-AGTCAGAAGCCGAGAAAG-3′，下游引物序列：5′-CCCAGCCACAGCAAGGT-3′；以β-actin為內參，上游引物序列：5'-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3'，下游引物序列：5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'。94oC變性3 min后，按下述條件擴增40個循環：95oC 5 s，65oC 35 s，72oC 60 s，循環后72oC延伸5 min。

1.2.6 Western blot檢測MDR1和LRP的表達水平 取對數生長期的A549/DDP細胞，加入2.5 μM或10 μM 4-苯胺喹唑啉，不加入4-苯胺喹唑啉做對照，繼續培養24 h后，收集細胞裂解提取蛋白。BCA法測定細胞裂解物的蛋白含量，取等量蛋白質用12% SDS-PAGE法進行分離，然后轉移到PVDF膜上，分別用MDR1抗體（1:800）和LRP抗體（1:500）孵育，4oC過夜，以特異性的辣根過氧化物酶連接的二抗溫育1 h，洗滌，顯示免疫反應條帶，以β-actin作為內參（Sigma，1:2,000）。

1.3 統計學方法 使用SPSS 11.5軟件進行分析，實驗數據以Mean±SD表示。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行比較，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Src酪氨酸激酶抑制劑對A549/DDP細胞增殖的影響CellTiter-Glo實驗結果顯示，4-苯胺喹唑啉對A549/DDP細胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性，通過細胞抑制曲線得出4-苯胺喹唑啉在2.5 μM時對A549/DDP細胞無明顯毒性（抑制率＜5%），在10 μM時有微弱毒性（抑制率10%-15%）（圖1），因此本研究選擇2.5 μM及10 μM 4-苯胺喹唑啉進行研究。

圖 1 Src酪氨酸激酶抑制劑4-苯胺喹唑啉對A549/DDP細胞增殖的影響和對藥物敏感性的逆轉作用Fig 1 The effect of 4-anilinoquinazoline on A549/DDP cells proliferation and reversal effect of drug sensitivity

2.2 抑制Src酪氨酸激酶活性可提高A549/DDP對順鉑的敏感性 CellTiter-Glo實驗結果顯示，2.5 μM和10 μM的4-苯胺喹唑啉可降低順鉑抑制A549/DDP的IC50值，順鉑抑制A549的IC50值為12.64 μM，A549/DDP的IC50值為52.61 μM，而2.5 μM 4-苯胺喹唑啉作用后順鉑對A549/DDP的IC50值為33.15 μM，10 μM 4-苯胺喹唑啉作用后順鉑對A549/DDP的IC50值為24.98 μM，逆轉倍數(reversal fold, RF)分別為1.59倍和2.10倍（圖1）。

2.3 抑制Src酪氨酸激酶活性可提高A549/DDP細胞中Rh-123的含量 流式細胞術檢測結果顯示，Src酪氨酸激酶抑制劑處理后A549/DDP細胞中的Rh-123含量明顯提高，2.5 μM和10 μM 4-苯胺喹唑啉處理的腫瘤細胞中Rh-123的平均熒光強度分別比對照組細胞提高了1.21倍和1.59倍（圖2），證明抑制Src酪氨酸激酶活性可降低腫瘤藥物外排，提高腫瘤細胞中藥物含量，從而提高腫瘤細胞藥物敏感性。

圖 2 抑制Src酪氨酸激酶活性對A549/DDP細胞內Rh-123蓄積的影響Fig 2 The effect of Src tyrosine kinase activity on the intracellular accumulation of rhodamine-123 in A549/DDP cells. A: The figure of the effect of Src tyrosine kinase activity on the mean fluorescence intensity of rhodamine-123 in A549/DDP cells; B: A graph representing the analysis of intracellular rhodamine-123 mean fluorescence intensity.Data presented are Mean±SD values from at least three independent experiments. Bars indicate SD.*, compared to control group, P＜0.05.

2.4 抑制Src酪氨酸激酶活性可下調MDR1和LRP基因轉錄RT-PCR結果顯示，2.5 μM和10 μM 4-苯胺喹唑啉處理后，A549/DDP細胞的MDR1基因的mRNA水平分別為對照組的53.8%和27.5%，LRP基因的mRNA表達分別是對照組的59.3%和21.4%（圖3），證明抑制Src酪氨酸激酶活性可下調腫瘤細胞MDR1和LRP基因的轉錄，從而降低上述蛋白表達，提高腫瘤細胞藥物敏感性。

圖 3 抑制Src酪氨酸激酶活性對A549/DDP細胞MDR1和LRP mRNA表達的影響。Fig 3 The effect of Src tyrosine kinase activity inhibition on the mRNA expression of MDR1 and LRP in A549/DDP cells. Data presented are Mean±SD values from at least three independent experiments. Bars indicate SD.*, compared to control group,P＜0.05. MDR1: muti-drug resistance 1; LRP: lung resistancerelated protein.

2.5 抑制Src酪氨酸激酶活性可下調MDR1和LRP蛋白表達Western blot檢測顯示，4-苯胺喹唑啉可降低A549/DDP細胞MDR1和LRP的蛋白水平，且呈現劑量依賴性（圖4），證明抑制Src酪氨酸激酶活性可下調腫瘤細胞MDR1和LRP蛋白表達，從而提高腫瘤細胞藥物敏感性。

圖 4 抑制Src酪氨酸激酶活性對A549/DDP細胞MDR1和LRP蛋白表達的影響Fig 4 The effect of Src tyrosine kinase activity inhibition on the protein expression of MDR1 and LRP in A549/DDP cells

3 討論

腫瘤細胞產生多藥耐藥性是臨床應用化療藥物治療腫瘤失敗的主要原因，研究腫瘤產生多藥耐藥性的機制及解決方法對提高化療藥物的臨床有效性具有重要意義。研究[7]顯示，腫瘤細胞可通過多種機制產生耐藥性：過表達ATP結合盒蛋白超家族（ATP-binding cassette protein super family）等跨膜蛋白基因，將進入腫瘤細胞內的藥物被泵出，減少細胞內的藥物濃度；過表達具有解毒和 DNA修復功能的酶，使細胞毒藥物效果減低；下調藥物靶點分子表達，降低藥物敏感性；激活抑癌基因，抑制藥物所致的細胞凋亡等。其中，被廣泛研究的機制是多藥耐藥蛋白MDR1及肺耐藥相關蛋白LRP高表達所引起的耐藥性，這些蛋白的表達降低腫瘤細胞內或者藥物靶附近的藥物濃度，導致給予的藥物無法有效地到達治療部位，從而產生耐藥性[8]。

PI3K-AKT通路是細胞內重要的信號轉導通路，在細胞的增殖和生存中起著重要作用，在不同類型的腫瘤中均可見此信號通路的過度表達[9]，已有研究[10]表明PI3K/Akt路徑的活化是腫瘤細胞對藥物耐受的關鍵調控因素。Src酪氨酸激酶活化后，可激活下游PI3K-AKT信號通路，活化下游相關的信號轉導通路，通過磷酸化IKKα/β蛋白，提高NF-κB活性，促進MDR1和LRP基因的轉錄。

MDR1是能量依賴性跨膜糖蛋白，在肺癌組織中廣泛表達，在正常肺組織中低水平表達或不表達。MDR1蛋白具有藥泵功能，當腫瘤細胞膜上過度表達MDR1蛋白時，MDR1可結合抗腫瘤藥物，通過ATP水解后釋放的能量，主動將進入細胞內的藥物泵出細胞外，降低細胞內藥物的濃度，產生耐藥[11]。

LRP近年來被發現是重要的耐藥基因，在肺癌中首先發現，是一種穹隆體主蛋白，在多種耐藥細胞株中均有過度表達。LRP可參與組成核孔復合物（nuclear pore complex,NPC）參與細胞核與細胞質間物質交換以及細胞質中的囊泡運輸。LRP比MDR1更早地表達在惡性腫瘤中，給予低濃度化療藥后即可見到LRP表達增加，而不需要高濃度化療藥刺激，其過度表達通過調節囊泡和核質的藥物轉運將藥物儲存于囊泡，減少其在核與胞質間的比例，可影響藥物的胞內轉運與分布而導致耐藥[12]。

由人肺癌細胞系A549連續暴露于順鉑后篩選出的耐藥A549/DDP細胞除耐受順鉑外，還對VP-16和CBP交叉耐藥，研究[13]顯示該細胞的多藥耐藥性與MDR1和LRP的高表達密切相關，是一株良好的工具細胞。Src酪氨酸激酶在腫瘤形成和發展中的重要性已經被人們所熟知，Src的異常活化導致了細胞的癌變并賦予腫瘤細胞存活的能力[14]。同時，最近的研究[15]顯示Src激酶還參與腫瘤細胞抵抗化療藥物，Src酪氨酸激酶抑制劑可以增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，甚至逆轉耐藥性。Src酪氨酸激酶與腫瘤耐藥性的關系并不十分清楚，Src酪氨酸激酶抑制劑在不同類型腫瘤耐藥細胞上的作用值得深入研究。

本研究顯示，Src抑制劑4-苯胺喹唑啉可抑制A549/DDP細胞中Src的激酶活性，表現為Src自身磷酸化水平降低，并且CellTiter-Glo試驗顯示這種抑制作用可進一步轉化為提高細胞對順鉑的敏感性。A549/DDP細胞耐藥性的主要機制之一是MDR1和LRP過表達，使得細胞外排藥物的能力增加導致藥物在細胞中的濃度降低，因而其耐藥性的逆轉很可能與藥物在細胞中的蓄積得以恢復有關。Rh-123作為MDR1的底物，可以指示細胞中該蛋白的功能強弱，并指示癌細胞對藥物的外排作用，因此我們利用流式細胞術研究了Src抑制劑對細胞Rh-123含量的影響。結果顯示，在Src抑制劑處理后，細胞的Rh-123含量明顯提高，說明抑制Src酪氨酸激酶活性逆轉A549/DDP細胞的耐藥性與其抑制藥物的外排、提高藥物在細胞內的蓄積有關，與我們的推測一致。進一步的Western blot研究顯示，抑制Src酪氨酸激酶活性下調了細胞MDR1和LRP蛋白的表達水平，與Rh-123含量實驗的結果相符。而real-time PCR研究顯示，抑制Src酪氨酸激酶活性下調MDR1和LRP蛋白的表達很可能是通過降低mRNA的轉錄水平來實現的，其機制可能是抑制Src酪氨酸激酶活性后，PI3K-AKT路徑受到阻斷，從而下調NF-κB等轉錄因子活性，降低了MDR1和LRP mRNA的轉錄水平。

綜上所述，本研究顯示抑制Src酪氨酸激酶活性可逆轉A549/DDP細胞多藥耐藥性，其機制可能與降低細胞MDR1和LRP的表達，恢復藥物在細胞內的蓄積有關。本研究結果為靶向作用Src的藥物運用與臨床逆轉MDR1或LRP介導的肺癌多藥耐藥提供了實驗基礎，其具體的作用機制有待進一步的研究。