吲哚-3-甲醇對肺癌細胞放射敏感性的EGFR依賴性調節

肖驍 孟慶慧 徐加英 焦旸 Eliot M Rosen 樊賽軍

近年來我國肺癌的發病率和死亡率迅速上升，已處惡性腫瘤的首位。雖然不同的治療方法和技術已不斷發展和完善，但肺癌的5年生存率的改善仍然不明顯。放射治療是最常用于肺癌的治療方法之一，其常在手術前后作為輔助治療手段應用，在一定程度上可以減少局部復發率、明顯改善癥狀、延長患者的生存期。但是肺癌細胞對放射治療產生耐輻射效應常常降低了放射治療的療效和廣泛的應用。影響肺癌放射治療療效的因素除了放射治療方法、肺癌臨床分期和病理類型、患者免疫狀態等因素外[1]，藥物和飲食也同樣可以影響放射治療的療效。本實驗研究了十字花科蔬菜中研究最多和最重要的一種抗腫瘤成分吲哚-3-甲醇（indole-3-carbinol, I3C）對肺癌細胞放射敏感性的影響及其與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）的調節關系。

1 材料與方法

1.1 肺癌細胞培養及試劑 3種肺癌細胞系來自美國Georgetown大學組織和細胞實驗中心。培養基為含10%小牛血清的RPMI-1640（Life Technology, USA）。吲哚-3-甲醇（I3C）購置于美國Sigma公司，并溶解在純度大于99%的二甲基亞砜（DMSO）中，配制成20 mmol/L的儲存液存于-20oC備用。

1.2 細胞照射 將指數生長的不同肺癌細胞分為I3C+γ-射線照射組和DMSO+γ-射線照射組，前者為肺癌細胞在5 μmol/L I3C作用24 h后，后者為肺癌細胞在同量的DMSO（作為對照）作用24 h后，在室溫下進行γ-射線照射。照射采用137Cs γ-射線照射源進行，劑量率為0.85 Gy/min。

1.3 MTT方法 取對數生長期的細胞，酶消化，接種于96孔培養皿中，24 h后細胞密度大約為40%-50%。除去培養液，加已加入了5 μmol/L I3C的培養液至相應的細胞孔中。置培養箱中繼續培養24 h和48 h后加入MTT（5 g/L）20 μL/孔，孵育4 h，棄液后加入DMSO 100 μL/孔，振蕩。最后采用酶標儀在570 nm波長檢測每孔細胞OD值，采用細胞存活率=加藥組吸光度值/對照組吸光度值×100%的方式計算細胞存活率。

1.4 克隆形成實驗 取指數生長期的肺癌細胞，經酶消化，計數后并按不同照射劑量（0 Gy-8 Gy）在60 mm直徑的培養皿中接種不同數量的細胞數，γ-射線照射組和I3C+γ-射線照射組每個劑量設6個副孔。培養貼壁8 h后，實驗組加含不同劑量I3C至相應的培養孔，對照組只換培養液，等藥物處理24 h后分別進行0 Gy-8 Gy γ-射線照射，照射后重新換培養基繼續培養大約2周至克隆形成。然后結晶紫染液染色，沖洗和晾干，顯微鏡下觀察并計數細胞數大于50個的細胞克隆數。按照“0 Gy劑量集落數/細胞接種數×100%”公式計算0 Gy組克隆形成效率，并按照某一劑量照射組的集落數/該組細胞接種數×未照射組克隆形成率（survival fraction, SF）。

1.5 siRNA轉染 EGFR siRNA（sc-29301）和Control siRNA（sc-37007）購置于美國Santa Cruz生物技術公司。取對數生長期的NIH-H1975細胞，調整細胞密度，接種至12孔培養皿，24 h后除去培養液，采用無血清和抗生素的培養液清洗。并根據Lipofectamine 2000轉染試劑的操作指南（Invitrogen, USA）將siRNA與Lipofectamine 2000分別用適量無血清和抗生素的培養液稀釋和混勻，20 min室溫靜置后取出并直接加入培養孔中，置于培養箱培養72 h進行I3C處理和/或γ-射線照射。

1.6 Western blot方法 細胞采用胰酶消化，離心5 min（2,500 r/min），棄上清，加入IP裂解液轉至1.5 mL離心管并置于冰上裂解2 h。4oC離心5 min（13,000 r/min）后，取上清，并采用BCA法檢測樣品中蛋白的含量。取總蛋白100 μg混合蛋白上樣緩沖液，在100oC加熱5 min，并采用10%的SDS-PAGE進行電泳分離，電泳后轉至PVDF膜上。轉膜結束后，采用5%脫脂奶粉封閉1 h。加入抗EGFR單克隆抗體（sc-7134）或抗EGFR磷酸化（phospho Y845）抗體（ab5636）4oC過夜，洗膜后加入相對應的二抗室溫孵育2 h，洗膜，最后加ECL顯色試劑盒顯影，膠片洗滌和干燥。測量目的條帶的光密度值。另外，采用抗β-actin多克隆抗體（I-19）檢測β-actin蛋白表達作為樣品內參以及轉膜的效果。抗EGFR、抗β-actin抗體和二抗都購置于美國Santa Cruz生物技術公司。抗EGFR磷酸化（phospho Y845）抗體購置于美國Abcam公司。

1.7 RT-PCR方法 根據RNA抽提操作手冊采用Trizol試劑提取組織總RNA。提取的RNA經電游鑒定其完整性，并采用紫外分光光度計測定260 nm與280 nm吸光度值從而計算RNA的純度與濃度。EGFR上游引物為：5′-TGG AGC TAC GGG GTG ACC GT-3′，下游引物為5′-TGG AGC TAC GGG GTG ACC GT-3′；GAPDH mRNA上游引物為：5′-AAG CCC ATC ACC ATC ヰC-CAG-3′，下游引物5′-AGG GGC CAT CCA CAG TCT TCT-3′。按試劑說明操作完成cDNA的合成，反應體系為：dNTP Mixture 1 μL，Template RNA 1 μg，RNase Free dH2O加至到10 μL，在65oC孵育5 min后，直接加入5×Prime Script Buffer 4 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、Prime Script RTase 0.5 μL和RNase Free dH2O 5 μL，然后分別置于30oC 10 min、42oC 20 min以及95oC 5 min。取逆轉錄反應液2 μL，加入10×PCR Buffer 2 μL、dNTP Mixture 0.8 μL、上下游引物各1 μL和RNase Free dH2O 13 μL。反應條件為：94oC預變性5 min，94oC變性1 min，60oC退火30 s，72oC延伸1 min，35個循環后在72oC延伸7 min。取最終反應產物10 μL在2%瓊脂糖凝膠進行電泳，溴乙啶染色，最后在紫外光下照相記錄。

1.8 統計學方法 所有實驗均重復3次，取平均值，結果用Mean±SD表示。采用SPSS 19.0統計軟件對相關數據進行統計分析，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

圖 1 I3C對肺癌細胞放射敏感性的影響。A：5 μmol/L I3C 24 h處理對三種肺癌細胞生長的影響；B：照射前5 μmol/L I3C的24 h預處理對三種肺癌細胞放射敏感性的影響。Fig 1 Effect of I3C on radiosensitivity of lung cancer cells. A: Effect of I3C (5 μmol/L, 24 h) on growth of three lung cancer cell lines; B: Effect of I3C at 5 μmol/L (24 h) before irradiation on radiosensitivity of three lung cancer cell lines.

2 結果

2.1 I3C對肺癌細胞放射敏感性的影響 首先我們采用MTT分析法比較了5.0 μmol/L I3C的24 h處理對NIH-H1975、NIH-H226和NIH-H520三種不同肺癌細胞系生長和增殖的影響。正如圖1A所示，5.0 μmol/L I3C對三種肺癌細胞生長影響較小，三種肺癌細胞對I3C的敏感性并無明顯差異，且抑制率均＜15%，表明5.0 μmol/L I3C的24 h處理并不產生明顯的細胞毒毒副作用。接下來，采用5.0 μmol/L I3C預處理不同細胞24 h，然后細胞接受不同劑量的γ-射線照射，并完成細胞克隆形成實驗。從圖1B可見，三種肺癌細胞放射敏感性分別為NIH-H520＞NIH-H1975＞NIH-H226，抑制50%細胞生長所需的輻射劑量（IC50）分別為0.4 μmol/L、1.0 μmol/L和1.4 μmol/L，而抑制90%細胞生長所需的輻射劑量（IC90）則分別為2.7 μmol/L、3.9 μmol/L和4.3 μmol/L。IC50和IC90在各細胞系之間相比較差異都具有統計學意義（P＜0.05）。另外，與對照DMSO+γ-射線照射的細胞存活曲線相比，I3C+γ-射線照射的NIH-H1975和NIH-H226細胞存活曲線明顯上移，即放射敏感性在不同程度上降低。例如，與DMSO+γ-射線照射細胞的IC50（1.0 μmol/L）和IC90（3.9 μmol/L）相比，I3C+γ-射線照射的NIH-H1975細胞的IC50和IC90分別為4.0 μmol/L和7.0 μmol/L，相比差異都具有統計學意義（P＜0.05）。但是，5 μmol/L I3C的24 h預處理并未明顯改變照射后NIH-H520細胞的存活曲線（圖1B）。

2.2 I3C對肺癌細胞株放射敏感性影響與EGFR表達水平的關系 已知肺癌細胞株中EGFR表達水平與肺癌放射敏感性有密切的相關性[2-4]。EGFR表達水平的差異和改變是否在I3C調節肺癌細胞放射敏感性中起到一定作用?為此，我們采用Western blot方法比較了NIH-H1975、NIH-H226和NIH-H520三種肺癌細胞系中內源性EGFR蛋白的表達水平。如圖2所示，在NIH-H1975和NIH-H226細胞中可以不同程度地檢測到EGFR蛋白的表達，NIH-H226細胞中的EGFR蛋白表達水平略比NIH-H1975細胞高。但在NIH-H520肺癌細胞中并未檢測到EGFR蛋白的表達。這些EGFR表達水平結果與以前已報道的結果完全一致[5]。

正如我們預期的，I3C處理的NIH-H520細胞中的EGFR蛋白無任何變化，依然無法檢測到EGFR蛋白的表達（圖2）。I3C處理不同程度地增加了NIH-H1975和NIH-H226兩種肺癌細胞系中的EGFR蛋白表達水平，且I3C增加NIH-H1975細胞中EGFR表達量（4.1倍）比其增加NIH-H226細胞中EGFR量（2.3倍）要高。另外，I3C也在不同程度上提高了NIH-H1975細胞（3.7倍）和NIH-H226細胞（2.8倍）中的EGFR蛋白在Y845位點的磷酸化水平。

為了進一步了解EGFR表達水平改變在I3C調節肺癌細胞放射敏感性中可能的作用，我們采用脂質體介導EGFR siRNA轉染至NIH-H1975細胞中降低EGFR的表達水平以觀察其放射敏感性的變化。如圖3所示，與NIH-H1975母細胞（Control）相比，對照siRNA（control siRNA）轉染細胞中的EGFR蛋白（圖3A）和mRNA（圖3B）表達水平無任何明顯改變。但轉染了EGFR siRNA的NIH-H1975細胞中EGFR蛋白和mRNA的表達水平都出現明顯下降，EGFR蛋白下降至母細胞EGFR量的8%。這些結果表明EGFR siRNA的轉染能有效地抑制EGFR蛋白和mRNA的表達水平。同時，我們也比較了I3C預處理對NIH-H1975母細胞、對照siRNA和EGFR siRNA轉染細胞放射敏感性的影響。如圖3C所示，照射后NIH-H1975母細胞和對照siRNA轉染的細胞存活曲線比較沒有明顯差異，而且I3C也明顯導致了NIH-H1975母細胞和對照siRNA轉染細胞的放射敏感性降低，降低的程度兩者之間也無明顯差異。但是，雖然EGFR siRNA明顯提高了細胞的放射敏感性，而I3C導致的耐輻射現象則明顯減弱。

圖 2 5 μmol/L I3C 24 h處理對三種肺癌細胞EGFR蛋白表達和ERFR磷酸化 （Y845）水平的影響。A：EGFR及pEGFR蛋白表達情況；B：三種細胞中EGFR的表達情況；C：三種細胞中pEGFR表達情況。Fig 2 Effect of I3C (5 μmol/L, 24 h) on expression of EGFR protein and phospho-EGFR (Y845) in three lung cancer cell lines. EGFR: epidermal growth factor receptor. A: the expression levels of EGFR and pEGFR;B: the expression level of EGFR in three lung cancer cell lines; C: the expression level of pEGFR in three lung cancer cell lines.

圖 3 降低EGFR表達對I3C調節放射敏感性的影響。EGFR siRNA轉染對H1925細胞中EGFR蛋白 (A) and mRNA (B) 表達的影響；C：照射前5 μmol/L I3C的24 h預處理對H1925母細胞，Control siRNA和EGFR siRNA轉染的H1925細胞放射敏感性的影響。Fig 3 Effect of EGFR decrease on radiosensitivity. Effect of EGFR siRNA transfection on expression of EGFR protein (A) and mRNA (B) in H1925 cells;C: Effect of I3C with 24 h treatment of 5 μmol/L before irradiation on radiosensitivity of H1925 parental cells and H1925 cells transfected with Control siRNA and EGFR siRNA.

3 討論

EGFR是一種細胞膜表面的糖蛋白受體，具有酪氨酸激酶活性，是原癌基因C-erb1（HER-1）的表達產物，屬于表皮生長因子家族（erbB家族）。EGFR在包括肺癌在內許多腫瘤組織中都呈現高水平表達，與其配體結合后被活化，在腫瘤細胞的增殖、轉移和腫瘤血管的生成中起到重要的作用，故EGFR已成為腫瘤治療的重要靶點，包括吉非替尼、厄洛替尼等針對EGFR靶點的特異性酪氨酸激酶抑制劑也已進入臨床治療治療試驗中[6,7]。當腫瘤細胞受到電離輻射照射后，EGFR進入細胞核，參與并加快了DNA損傷的修復，從而降低了放射損傷[8]。研究[3]表明EGFR高表達的腫瘤細胞對放射治療表現為比較低的放射敏感性。另外，通過采用特異性EGFR抑制劑抑制EGFR的表達及其調節通路的活性，都可以通過促進腫瘤細胞凋亡、改變輻射誘導的細胞周期阻滯，增加輻射誘導的DNA損傷修復能力等作用機制而降低肺癌的放射治療敏感性[3,8-14]。而且研究[14]也發現EGFR蛋白結構中酪氨酸激酶域、L858R和DeltaE746-E750三個蛋白區域是EGFR調節放射敏感性的關鍵所在。

我們的實驗研究結果表明，①三種肺癌細胞中EGFR表達水平與其放射敏感性成負相關，EGFR蛋白表達水平最高的NIH-H226細胞，其放射敏感性則最低。相反，EGFR表達陰性的NIH-H520細胞則表現高放射敏感性。不同肺癌細胞的放射敏感性與其內源性EGFR蛋白表達水平成負相關，通過EGFR siRNA降低EGFR表達水平可以提高肺癌細胞的放射敏感性；②輻射照射前給予I3C預處理可以明顯增加EGFR陽性的肺癌NIH-H1975和NIH-H226細胞放射敏感性；③I3C可以增加EGFR陽性的肺癌細胞中EGFR蛋白的表達以及在EGFR蛋白Y845位點的磷酸化水平。在NIH-H1975細胞中，I3C可提高EGFR蛋白表達量和Y845位點的磷酸化水平，降低細胞的放射敏感性程度更明顯。而對EGFR陰性的肺癌NIH-H520細胞放射敏感性則無明顯影響。這些實驗研究結果表明I3C導致肺癌細胞放射敏感性降低的原因可能是與其增加EGFR表達和磷酸化有關。其四，采用EGFR siRNA降低肺癌細胞中EGFR蛋白表達水平可以降低I3C導致的耐輻射抗性。一系列體外實驗研究結果都證實I3C處理可以降低肺癌細胞放射敏感性，EGFR蛋白表達及其磷酸化水平的增加可能是I3C導致的肺癌細胞耐輻射抗性的主要原因。這些研究結果說明降低EGFR表達水平可以增加NIH-H1975細胞的放射敏感性或起著關鍵性作用。換句話說，EGFR可能是I3C調節肺癌細胞放射敏感性的靶蛋白。雖然目前EGFR信號傳導的具體機制還不清楚，但研究發現EGFR激活后可激活不同下游信號通路，比較明確的主要有ras-raf-MEK-erk/MAPK信號通路和P13K-PKC-IKK信號通路兩條途徑。因此，我們實驗室目前正在深入了解EGFR調節的這兩條下游信號通路的激活是否在I3C耐輻射抗性中起到關鍵作用，同時也正在研究與放射敏感性相關的EGFR蛋白結構中酪氨酸激酶域、L858R和DeltaE746-E750三個蛋白區域是否也參入I3C導致的耐輻射效應。另外，EGFR不同蛋白位點的磷酸化是EGFR行使其生物學功能的重要機制。雖然我們已證實I3C可以誘導EGFR蛋白Y845位點的磷酸化，但對EGFR蛋白其它磷酸化位點，例如Y1068、Y1173和Y1148，是否同樣有激活效應也是我們需要進一步研究的內容。同樣，是否這些磷酸位點的磷酸化改變在I3C調節肺癌放射敏感性中起到關鍵和必要的作用將為我們深入研究I3C導致耐輻射效應提供新的研究方向。

I3C是小白菜、菜心、大白菜、芥藍、青花菜、葉芥菜等十字花科蔬菜中主要的植物化學物質，其具有的防癌和抗癌作用引起研究人員和臨床腫瘤醫生的極大的關注和廣泛的研究[15,16]。世界上十字花科植物有3,200多種，來源非常廣，是我國飲食中常見的一類蔬菜。運輸冷凍、切碎和烹調等食物加工處理和咀嚼可使十字花科菜中的細胞受到破壞，導致葡糖異硫氰酸鹽經黑芥子硫苷酶水解后可以生成I3C及異硫氰酸鹽。I3C進入胃后在胃酸環境中非常不穩定，通過縮合反應形成其它的多聚物，包括3,3’-二吲哚甲烷（DIM）、吲哚[3,4-b]并咔唑（ICZ）和2-（吲哚-3-基甲基）-3,3二吲哚甲烷（LTr-1）等。并且，在血液中也是以這幾種代謝產物為主要成分存在。這些吲哚-3-甲醇的酸性縮合物也都具有非常強的生物活性，其中以DIM和ICZ兩種產物活性最強。因此，我們將非常有興趣地了解是否I3C的這些代謝產物也同樣具有影響肺癌細胞放射敏感性的功效。吲哚-3-甲醇是十字花科蔬菜中主要的活性成分，因此肺癌放射治療患者在臨床放射治療前如果食用一定量的十字花科蔬菜或攝取I3C后是否將對其放射治療的療效產生一定的影響目前還需要做進一步探討和研究。

另外，我們早期的研究結果揭示，I3C是DNA損傷修復基因乳腺癌易感基因-1（breast cancer susceptibility gene 1, BRCA1）的誘導劑，可以明顯地增加腫瘤細胞中BRCA1基因的表達水平[17,18]。近年來，研究[19-24]表明BRCA1表達可能也是肺癌一重要的獨立或輔助預后指標。但引人關注的是越來越多的國內外研究[25-35]結果已證實BRCA1是參與包括吉西他濱、多烯紫杉醇、順鉑等在內的肺癌常用化療藥物敏感性調節和預后的相關基因。例如在順鉑化療耐藥肺癌患者癌組織樣本中的BRCA1蛋白陽性表達率明顯高于化療敏感患者樣本。也就是說，BRCA1表達陰性有利于肺癌化療治療療效，BRCA1的高表達則降低了肺癌細胞對化療的反應或治療效果[26-35]。因此，BRCA1是預測肺癌一定化療藥物療效的重要指標。而且，結合EGFR和BRCA1的指標更能有效地指導肺癌的個體化化療治療[26,36]。但至目前為止，國內外還沒有任何有關BRCA1調節肺癌放射敏感性的相關文獻報道。因此，除了研究BRCA1基因表達水平自身是否與肺癌放射治療療效有關外，BRCA1的表達改變是否也參與在I3C的EGFR依賴性的肺癌細胞放射敏感性調節機制中也有待進一步深入研究。