靈芝多糖對2型糖尿病大鼠心肌組織氧化應激的影響

馮 艷

江蘇省南通市第三人民醫院藥劑科，南通 226006

靈芝（Ganoderma lucidum）在我國自古就有“仙草”的美譽，已有悠久的藥用和食用歷史，《神農本草經》、《本草綱目》中都有靈芝的藥效記載。靈芝是滋補強壯、扶正固本的珍貴藥材。研究表明其主要有效成分是靈芝多糖（Ganoderma Polysaccharides，GLPs），具有免疫調節、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗氧化和延緩衰老等作用[1]。

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）患者嚴重的并發癥之一，其臨床發生率約為75%。有研究表明，糖尿病心肌纖維化與氧化應激之間關系密切。Brownlee[2]提出的糖尿病并發癥統一學說更是引起廣泛關注，該學說認為:高血糖引起線粒體中超氧陰離子生成過多，引起多元醇通路的激活、糖基化終末產物的形成、蛋白激酶C（PKC）途徑及氨基己糖途徑的激活，引起細胞功能紊亂，最終導致糖尿病并發癥的發生。因此，氧化應激可與糖基化終末產物（AGEs）相互作用加重纖維化，若能尋求有效的物質來降低機體氧化應激水平，對于糖尿病的心肌組織將具有明顯的保護作用。

DCM發病機制尚未明確，近年已有研究提示氧化應激在DCM發生和發展的各個環節中起了重要作用[3-4]。本實驗旨在研究GLPs對2型糖尿病（T2DM）大鼠氧化應激的影響，通過檢測心臟組織中 NO、SOD、MDA、CAT、GSH-Px的含量變化，以分析其作用是否與抗氧化應激有關，為今后更深入研究GLPs藥理作用提供依據。

1 材 料

1.1 藥物與試劑

靈芝多糖（江蘇安惠生物科技有限公司，批號:110601）；小檗堿（南京白敬宇制藥有限責任公司，批號:110501）；鏈脲佐菌素（streptozotocin,STZ，sigma公司）； 一氧化氮（NO）試劑盒（批號:20110407）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）測試盒（批號:20110411）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-PX）測試盒（批號:20110411）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號:20110312）、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒（批號:20110313）均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器

Touch-one血糖儀（美國強生醫療器材有限公司）；BH-NIC-B型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 動物

SD清潔級大鼠80只，雌雄各半，體重150～180 g，由南通大學實驗動物中心提供，動物許可證:FYXK（蘇）2007-0021。

2 方 法

2.1 動物模型的建立與分組

將大鼠隨機分為正常對照組（N組，10只）和造模組（70只）。造模組大鼠，雌雄各半，給予高能量飲食（飼料配方:脂肪20%、奶粉5%、蛋黃粉5%、基礎飼料70%），4周后禁食12h，由腹腔注射STZ 30mg·kg-1（臨用前用0.1 mol·L-1的檸檬酸緩沖液配成濃度為1%的STZ溶液）。注射STZ 1周后，測空腹血糖，血糖值≥16.7 mmol·L-1即造模成功，繼續高脂飲食。取成模大鼠50只，隨機分為5組，每組10只:模型組（DM組）、靈芝多糖低劑量組（GLPs-L組，200mg·kg-1）、靈芝多糖中劑量組（GLPs-M 組，400mg·kg-1）、靈芝多糖高劑量組（GLPs-H 組，800 mg·kg-1）、小檗堿組（Ber組，30 mg·kg-1）。每天灌胃給藥 1次，持續12 w。實驗期間，各組大鼠均正常喂養，自由飲水。

2.2 各項指標測定

第12 w末，測量大鼠體重，禁食12 h后，經尾靜脈取血測空腹血糖，取心肌組織測定NO、SOD、MDA、CAT 及 GSH-Px。心臟組織中 NO、SOD、MDA、CAT、GSH-Px的測定，按試劑盒說明書操作。

2.3 數據處理

3 結 果

3.1 動物一般情況

實驗期間，N組大鼠活動自如，外觀狀態良好，進水、進食量穩定；模型組大鼠毛色無光澤，活動力差，出現多飲、多食現象；GLPs-M組、GLPs-H組和Ber組的大鼠一般情況與模型組相比有明顯改善。

3.2 靈芝多糖對T2DM大鼠血糖的影響

12周后，與DM組相比，GLPs-L組經治療后血糖無明顯變化（P＞0.05），GLPs-M 組和 GLPs-H 組血糖濃度較DM組相比均明顯下降（P＜0.01），而GLPs-H組血糖顯著低于GLPs-M組和Ber組（P＜0.05）。見表1。

表1 灌胃靈芝多糖對T2DM大鼠血糖的影響（n=10）

3.3 靈芝多糖對 T2DM大鼠心肌 NO、SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量的影響

與N組相比，DM組心肌NO水平明顯降低（P＜0.01）；與DM組相比，給藥后GLPs-L組無明顯變化（P＞0.05），GLPs-M 組、GLPs-H 組和 Ber組明顯上升（P＜0.01）；與 Ber組相比，GLPs-M 組沒有統計學差異（P＞0.05），而GLPs-H組的效果要明顯優于GLPs-M 組和 Ber組（P＜0.05）。

DM組心肌MDA含量比N組明顯增高（P＜0.01）；與DM組相比，給藥后GLPs-L組無明顯變化（P＞0.05），而 GLPs-M 組、GLPs-H 組和 Ber組與DM組相比，MDA含量下降顯著（P＜0.01）。GLPs-H組與GLPs-M組和Ber組相比，更能降低MDA含量（P＜0.01）。

DM組心肌組織中SOD、GSH-PX、CAT活性與N組比較均明顯降低（P＜0.01）；與DM組相比，GLPs-L 組無明顯變化（P＞0.05），GLPs-M 組、GLPs-H組和Ber組明顯上升（P＜0.05或 P＜0.01）； 其中GLPs-M組和Ber組相比，均無統計學差異（P＞0.05），而 GLPs-H 組 SOD、GSH-PX、CAT 水平高于GLPs-M 組和 Ber組（P＜0.01）。見表 2。

表2 靈芝多糖對T2DM大鼠心肌NO含量、抗氧化酶活性及脂質過氧化物的影響（±s，n=10）

表2 靈芝多糖對T2DM大鼠心肌NO含量、抗氧化酶活性及脂質過氧化物的影響（±s，n=10）

注:與 N 組相比，**P＜0.01；與 DM 組相比，#P＜0.05、##P＜0.01；與 GLPs-M 組和 Ber組相比，△P＜0.05、△△P＜0.01

3.4 靈芝多糖對T2DM大鼠心肌細胞超微結構的影響

如圖1所示，N組心肌細胞內肌原纖維清晰，排列整齊，橫紋清楚，線粒體串珠樣整齊排列于肌原纖維之間，形態大小正常，可見清晰的閏盤；DM組和GLPs-L組心肌細胞內肌原纖維模糊，排列紊亂，斷裂嚴重，橫紋不清，線粒體大量增生，分布紊亂，腫脹變形，可見閏盤；GLPs-M組和Ber組較DM組明顯好轉，心肌膠原纖維排列相對整齊，可見閏盤，線粒體增生以及水腫減輕，但有一定程度的扭曲、斷裂；GLPs-H組大部分肌原纖維排列緊密，線粒體增生明顯減少，水腫明顯好轉，排列較整齊，可見閏盤，扭曲斷裂程度較GLPs-M組和Ber組減輕。

圖1 靈芝多糖對T2DM大鼠心肌細胞超微結構的影響（12000×）

4 討 論

糖尿病心肌病變是由糖尿病所致的一種心臟疾病，與血管及瓣膜病理改變無關，隨著病情的發展逐漸出現心肌收縮力減弱，心肌舒張受限，每搏心輸出量顯著減少，并出現代償性的左心室肥厚，最終導致充血性心力衰竭。糖尿病時，機體的高糖環境是糖尿病心肌病發生和發展的始動因素[5]。因此如能有效地降低機體內血糖水平，對DCM的預防和治療具有重大意義。本實驗中發現高劑量GLPs能夠有效降低T2DM大鼠血糖水平。已有研究發現，GLPs可能是通過修復T2DM大鼠的胰島素β細胞，促進胰島素的釋放，從而降低血糖[6]。

Kakkar等[7]學者研究發現，T2DM大鼠的心臟脂質過氧化程度明顯增加；Cail等[8]也在2型DM患者的血液和心肌組織中發現有氧化應激標志物的存在。在高糖環境下，機體一方面清除氧自由基的酶（SOD、CAT、GSH-Px）活性降低；另一方面體內的氧化應激作用增強，造成了體內大量活性氧自由基的積聚，導致活性氧連鎖反應，從而促進糖尿病心腦血管以及其他一系列并發癥的發生和發展[9]。

小檗堿（Berbrine，Ber），又稱黃連素，是黃連的主要活性成分。它具有良好的降血糖作用，并且對防治糖尿病心肌并發癥也具有一定的療效[10]。目前已被用于臨床治療或者輔助治療DM。本實驗中，GLPs-M組的療效與Ber組相當，GLPs-H組各個指標的改善都優于Ber組。

本研究顯示，GLPs的中、高劑量可以有效地提高其心肌組織中SOD、CAT、GSH-Px的活性，提高心肌組織中的NO含量，并降低MDA含量，高劑量組的療效要優于小檗堿組，表明GLPs對于防治DCM的發生發展具有一定的功效，而且GLPs防治DCM機制，除了本身降血糖的作用外，抗氧化應激可能也發揮著重要作用。DCM的發生和發展是受多種因素影響的，比如蛋白激酶C的活化、腎素血管緊張素系統的激活、心肌血管內皮功能的紊亂等，靈芝多糖是否能通過這些途徑來預防DCM的發生和發展，還需要更深入、更廣泛的研究。

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[4]Hamblin M,Friedman DB,Hill S,et al.Alterations in the diabetic myocardialproteome coupled with increased myocardial oxidative stress underlies diabetic cardiomyopathy[J].Mol Cell Cardiol,2007,42(4)∶884-95.

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[10]趙洪濤.黃連素對實驗性2型糖尿病大鼠心肌SOD活性、MDA含量水平的影響 [J].牡丹江醫學院學報，2007，28（3）:9-11.