阿托伐他汀抑制ox-LDL誘導的人臍靜脈內皮細胞表達胸腺基質淋巴細胞生成素TSLP的表達①

昌 薇 何少林 林 靜 趙 卉 李大主

(華中科技大學同濟醫學院協和醫院心內科，武漢430022)

現有研究證實動脈粥樣硬化(AS)為一慢性免疫炎性疾病，血管內皮細胞在經受多種危險因素(如ox-LDL)的刺激、損傷后表達多種炎性介質，激活并誘導各種免疫炎癥細胞(如巨噬細胞、樹突狀細胞、T細胞等)聚集于內膜下，參與粥樣斑塊的發生發展［1］。他汀類調脂藥物可延緩和消退動脈粥樣硬化病變，其機制主要是通過其調脂作用和一系列非調脂作用實現［2］。近期研究發現，阿托伐他汀可在體抑制冠心病患者樹突狀細胞的功能［3］，從而達到抗炎的作用，但這一作用的具體機制尚不明確。近年對新型細胞因子——胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)的多項研究發現，其是樹突狀細胞最強烈的激活因子，在啟動許多炎癥性疾病的發病中起“總開關”的作用［4］，但其是否在動脈粥樣硬化過程中起作用尚未見報道。我們近期研究發現，ox-LDL可刺激血管內皮細胞顯著表達TSLP，在AS炎癥反應的啟動中可能發揮作用［5］。阿托伐他汀的免疫抑制和抗炎作用是否源于其對血管內皮細胞TSLP表達的抑制目前尚無研究，本文就此進行探討。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 新生胎牛血清和DMEM培養基購于Gibco-RBL公司，按照說明書配制，4℃保存，血清在使用前用56℃水浴30分鐘滅活補體后分裝，－20℃保存;氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)購于Sigma公司;DMSO購于上海華美生物工程公司;Trizol試劑盒購于Gibco-RBL公司;逆轉錄試劑盒購于日本TOYOBO公司;實時定量試劑盒購于日本TSKARA公司;TSLP ELISA試劑盒購于Biolegend(San Diego，USA)公司;免疫熒光一抗試劑購于 Abcam(Cambridge，UK)公司，免疫熒光二抗試劑盒及DAPI購于博士德公司。阿托伐他汀為輝瑞公司提供的實驗用藥。

1．2 方法

1．2．1 內皮細胞的培養 人臍靜脈內皮 HUVEC由華中科技大學同濟醫學院基礎學院提供。用DMEM/F-12培養液(含10%滅活胎牛血清 ，100 U/L青、鏈霉素)在37℃、飽和空氣濕度、含5%CO2的培養箱內常規傳代培養。細胞長至約80%融合，倒去培養液，PBS洗2～3次，0．25%胰蛋白酶消化收集細胞，制成單細胞懸液。

1．2．2 實驗分組 人臍帶靜脈內皮細胞培養72小時，按如下分組:(1)對照組:加入50 mg/L的ox-LDL后繼續培養12小時;(2)阿托伐他汀處理低濃度組:加入 50 mg/L的 ox-LDL和阿托伐他汀1 μmol/L后繼續培養12小時;(3)阿托伐他汀處理高濃度組:加入50 mg/L的ox-LDL和阿托伐他汀10 μmol/L后培養12小時;分別于6小時和12小時取上清和細胞檢測。

1．2．3 ELISA檢測上清液TSLP濃度 操作按試劑盒說明進行。

1．2．4 RT-PCR定量分析TSLP mRNA表達 ①用一步法提取細胞總RNA:提取的總RNA經電泳鑒定未被降解，用72-1分光光度計測RNA在260 nm和280 nm的吸光度(A)值，根據260 nm的吸光度值對樣品的總RNA進行初步定量。②逆轉錄反應:應用TOYOBO逆轉錄試劑盒配制20 μl反應體系，在T gradient梯度PCR儀進行逆轉錄反應得到cDNA。③RealTime RT-PCR應用TaKaRa實時定量試劑盒配制25 μl反應體系。TSLP的上游引物:TATGAGTGGGACCAAAAGTACCG;下游引物:GGGATTGAAGGTTAGGCTCTGG;內參照GAPDH的上下游引物如下;上游引物:CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA;下游引物:TCTAGACCGCAGGTCAGGTCCACC。在ABI Step one實時熒光定量PCR儀上擴增。TSLP mRNA相對表達水平用CT比較法2-△△CT表示。

1．2．5 免疫熒光染色檢測細胞TSLP表達 在 6孔板內預置一蓋玻片，接種HUVECs(1×106/孔)，ox-LDL和阿托伐他汀處理6或12小時后，將含有貼壁細胞的蓋玻片用PBS浸洗3次，4%多聚甲醛固定20分鐘，取出蓋玻片固定于載玻片上，PBS洗3次;加5%BSA封閉液封閉30分鐘，封閉非特異性抗原，吸取余液。PBS漂洗3次;吸去PBS液，滴加第一抗體(TSLP 1∶400濃度稀釋)，每張切片加入50 μl稀釋液，4℃過夜;PBS洗3次，吸去 PBS液，加入CY3-羊抗兔二抗(1∶50)孵育1小時后流水沖洗3分鐘，PBS洗2次后加DAPI染細胞核5分鐘，吸出余液后PBS洗3次，用緩沖甘油封片，立即激光共聚焦顯微鏡照相。陰性對照采用PBS代替一抗，其余步驟相同。用IPP軟件對免疫熒光結果進行圖像處理，TSLP陽性表達用平均積分光密度表示。

1．3 統計學處理 實驗數據以x±s表示，結果均用SPSS13．0統計軟件進行統計學處理。

2 結果

2．1 阿托伐他汀抑制HUVECs TSLP分泌 對照組6小時和12小時 的 TSLP濃度分別為(8．94±1．52)和(11．42 ±1．87)pg/ml(圖 1)，表明 TSLP 的表達呈時間依賴性;阿托伐他汀低濃度組6小時與12小時的 TSLP 濃度為(7．02 ±0．82)，(9．55 ±1．24)pg/ml;阿托伐他汀高濃度組的TSLP濃度分別為(5．69 ±0．64)，(7．32 ±0．93)pg/ml;與同時間對照組比較，均顯示TSLP濃度的有顯著性下降，P＜0．001;低濃度組與高濃度組間亦有顯著性下降，P＜0．01;并顯示出劑量依賴性。

2．2 阿托伐他汀抑制HUVEC TSLP mRNA表達

經TSLPmRNA定量分析發現，對照組在6小時和12小時TSLPmRNA均有高表達(圖2)，實驗組和同時間對照組比較，TSLPmRNA均顯示出顯著性下降(P ＜0．001)，組間有顯著性差異(P ＜0．01)及劑量依賴性。

圖1 對照組和實驗組上清液中的TSLP濃度Fig．1 Release of TSLP protein in cell supernatants in control group and atorvastatin groups

圖2 對照組和實驗組細胞內TSLP mRNA表達Fig．2 Release of TSLP mRNA by HUVECs in control group and atorvastatin groups

圖3 HUVEC TSLP表達的免疫熒光染色(×400)Fig．3 Immunofluorescence staining analysis of the expression of TSLP in HUVEC (×400)

2．3 阿托伐他汀抑制HUVEC TSLP的表達 如圖3所示，對照組HUVEC均顯著表達TSLP，6小時和12小時的平均積分光密度分別為3．429±1．776，4．978±1．525;阿托伐他汀低濃度組在6小時和12小時的平均積分光密度為 3．397 ±1．141，4．803 ±1．614;其高濃度組為 3．256 ± 1．686，4．721 ±1．522，均見顯著性抑制TSLP表達，與同時間對照組比較，均有顯著性差異(P＜0．001)，組間亦有顯著性差異(P ＜0．01)。

3 討論

現有研究發現動脈粥樣硬化(AS)是一慢性免疫炎癥性疾病。多種危險因素(如ox-ldl)通過不同或相似的途徑損傷血管內皮細胞，使后者細胞內膽固醇聚集，并觸發細胞內信號瀑布，導致一系列促炎因子表達，促使樹突狀細胞、巨噬細胞、T細胞等各種免疫炎性細胞活化、遷移、粘附、聚集于內膜下，啟動和促進血管局部的炎癥反應［1，6］。胸腺間質淋巴細胞生成素(TSLP)是近年來發現的一種細胞因子，在人類其主要表達于上皮細胞和平滑肌細胞［7］，在心、肝、肺等臟器也見表達。研究發現，TSLP是樹突狀細胞最強烈的激活因子，在許多炎癥性疾病的發病如哮喘、過敏性鼻炎、皮膚過敏、慢性阻塞性肺疾病、椎間盤突出癥等的炎癥反應中起“總開關”的作用，其主要生物學作用是通過State5和State3途徑的激活，增加CD83、CD86、OX40L和MHCⅡ等因子的表達激活樹突狀細胞，促進 T細胞分化［3，8］。我們前期研究發現，受ox-LDL刺激的內皮細胞可明顯表達胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)［4］，后者可以活化樹突狀細胞和巨噬細胞，促進T細胞分化。在本實驗中我們進一步證實，受ox-LDL刺激后，HUVECs中TSLP的表達增多呈時間-劑量依賴性，這說明TSLP在AS發生發展相關的危險因素-血管內皮損傷-樹突狀細胞活化-炎性激活這一通道中可能起到重要的作用。

他汀類調脂藥物可延緩和消退動脈粥樣硬化病變，其機制主要是通過其調脂作用和一系列非調脂作用實現，起到改善血管內皮細胞功能，修復受損內皮，穩定動脈粥樣硬化斑塊，抑制炎癥反應等作用［9］。他汀類藥物能使內皮型一氧化氮合成酶(eNOS)mRNA表達增加，同時可以增強eNOS的活性，從而使一氧化氮增多，對內皮起保護作用［10］。其他作者研究表明阿托伐他汀可抑制血管內皮細胞表達分泌多種炎性介質或細胞因子如組織蛋白、白介素6、白介素8及單核細胞趨化蛋白-1等，作用呈劑量依賴性［11，12］。我們前期研究發現，阿托伐他汀可降低冠心病患者循環C-反應蛋白(CRP)的水平，抑制樹突狀細胞的功能［2］，達到抗炎的作用。但這一作用是否通過抑制內皮細胞TSLP的表達介導尚不清楚。本實驗中，我們通過將經ox-LDL刺激的內皮細胞與不同濃度的阿托伐他汀共培養，用多種方法檢測發現，HUVECs培養上清中TSLP的濃度，細胞中TSLP mRNA表達及胞漿中TSLP的蛋白表達水平，都較對照組顯著下降，其作用呈劑量依賴性。考慮到TSLP對樹突狀細胞的特異的活化作用，我們推測在體阿托伐他汀可能抑制內皮細胞TSLP的分泌，從而間接抑制樹突狀細胞的激活。不過本實驗中，阿托伐他汀組未觀察到TSLP的表達呈時間依賴性減少，分析其原因，可能是由于實驗觀測時間點的選擇較少，未能顯示出阿托伐他汀對TSLP抑制作用的作用時間曲線，這將在今后的機制研究中進行進一步的探討。

本實驗結果表明阿托伐他汀可抑制ox-LDL誘導的HUVECs TSLP的表達，這可能是阿托伐他汀抗炎，穩定動脈粥樣斑塊作用的原因之一。

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