紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡糖苷對免疫效應細胞增殖格局的調節作用①

余曉曦 孟凌華 余奇文 (上海交通大學醫學院藥學系，上海200025)

CD8+CTL細胞、NK細胞和NKT細胞是一類具有細胞毒作用的免疫效應細胞，在抗腫瘤免疫等方面發揮重要作用。腫瘤過繼性細胞免疫治療是將從個體中分離獲取的淋巴細胞經體外刺激，通過調節免疫細胞的數量和功能后，回輸人體發揮抗腫瘤作用，其關鍵是如何在短時間內誘導細胞快速增殖并達到理想的效應細胞組成格局。花青素(Anthocyanidin)又稱花色素，基本結構為2-苯基苯并吡喃型陽離子，常與一個或多個葡萄糖形成各種花色苷而廣泛存在于藍莓、葡萄、紫甘薯、黑加侖、胡羅卜、紫蘇和紅甘藍等植物中，發揮抗氧化作用［1］。花青素具有增強免疫功能、抑制腫瘤細胞生長、保護肝臟以及有效減輕由氧化應激引起的神經細胞損傷等作用［2，3］。我們從紫蘇葉中提取花青素的有效成分紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷，刺激誘導人外周血單個核細胞，觀察 CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、NK細胞以及NKT細胞等免疫效應細胞增殖格局的變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 湖北紫蘇葉，由本院藥化教研組提供;人參皂苷Rh2，上海源葉生物科技有限公司產品;熒光標記抗體:CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-APC cocktail、CD56-FITC、Va24-Ja18-TCR-PE，eBioscience產品;RPMI1640培養液，Gibco產品;LymphoprepTM(1.077 ±0.001)g/ml，Norway產品;rIL-2，上海華新生物制品公司產品;rINF-γ，Quantikine產品;抗人CD3單克隆抗體，由上海市免疫學研究所提供;人AB型血清，由上海市血液中心提供。

1.2 主要儀器 制備型HPLC(Agilent1200);分析型HPLC(Agilent1100);FACS-Calibur流式細胞儀(BD公司)。

1.3 紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷分離提取取湖北省野生半紅紫蘇葉82.3 g，以50 mmol/L硫酸-50%甲醇溶液于室溫下低速攪拌浸泡，浸出物用等體積乙酸乙酯作液液萃取，水相萃取物以配備Kromasil C18 柱(粒徑5 μm，21.2 ×250 mm)的 Agilent1200制備型液相色譜進行分離，流動相A為2%甲酸/水、B為甲醇，流速10 ml/min，甲醇比例在50分鐘內由40%增至70%梯度洗脫。

1.4 紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷鑒定 分離產物經Agilent1100 HPLC分析，采用Kromasil C18柱(粒徑5 μm，4.6 ×250 mm)，VWD 可變波長檢測器，檢測波長分別為325 nm和530 nm，流動相A為4%甲酸/水，B為4%甲酸/乙腈，流動相A在0到60分鐘內由94%變化到78%，流速0.8 ml/min。

1.5 細胞刺激培養 取2支抗CD3單克隆抗體，以20 ml生理鹽水溶解制成包被液，0.22 μm過濾器除菌，然后加至48孔細胞培養板孔內，每孔400 μl，置4℃冰箱過夜，次日棄去包被液備用。取正常人肝素抗凝靜脈血，用培養液對倍稀釋，用 LymphoprepTM，2 000 r/min，20 分鐘分離單個核細胞，用培養液洗滌細胞3次，計數細胞，并以含有10%AB型人血清、1 000 U/ml IL-2、1 000 U/ml IFN-γ 的RPMI1640培養液調節細胞濃度為5×105ml-1，加入到包被有CD3單克隆抗體的細胞培養板中，每孔600 μl，3復孔。分別設置實驗組和對照組，實驗組刺激物分別為紫蘇寧、矢車菊素3，5-二葡萄糖苷、紫蘇寧+矢車菊素3，5-二葡萄糖苷、PHA、人參Rh2等。PHA為1%、0.1%和0.01%3種濃度，其他刺激物均為 100、10、1.0 μg/ml 3 種濃度。37℃，5%CO2培養箱內培養，每3天換半液，于第4、7天取細胞進行熒光抗體染色，FACS檢測。

1.6 流式細胞術檢測細胞表型 取1×105個培養細胞，用1%FBS-PBS洗滌，洗滌后細胞懸浮于100 μl 1%FBS-PBS，加入熒光抗體，室溫避光培養30分鐘，洗3次，上FACS儀檢測CD3+T細胞數、CD4+T細胞數、CD8+T細胞數、NK細胞數以及NKT細胞數。

1.7 統計學分析 組間樣本采用t檢驗，結果用x±s表示，P＜0.05表示具有統計學差異。

2 結果

2.1 紫蘇寧和矢車菊3，5-二葡萄糖苷提取與鑒定結果 從82.30 g紫蘇葉中分離提取得到0.33 g紫蘇寧和0.35 g矢車菊素3，5-二葡萄糖苷，經鑒定與國外實驗HPLC峰譜一致［4］。從圖1可見紫蘇寧(A1)在波長325 nm和530 nm下幾乎無雜質峰，達到了較高的純度，在近52分鐘時形成波峰;矢車菊素3，5-二葡萄糖苷(A2)在波長325 nm和530 nm下有少量雜質峰，在18分鐘附近形成波峰。

2.2 不同濃度紫蘇寧和矢車菊3，5-二葡萄糖苷對免疫效應細胞的刺激 以①100 μg/ml、②10 μg/ml、③1.0 μg/ml 3 種濃度的紫蘇寧、矢車菊素 3，5-二葡萄糖苷、紫蘇寧+矢車菊素3，5-二葡萄糖苷刺激正常人外周淋巴細胞，刺激7天以后免疫效應細胞組成格局變化見表1。

圖1 紫蘇寧(A1)和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷(A2)HPLC鑒定圖譜Fig．1 Identification of Shisonin(A1)and Cyanidin(A2)with HPLC

2.3 紫蘇寧和矢車菊3，5-二葡萄糖苷與PHA和人參皂苷Rh2刺激比較 以紫蘇寧、矢車菊素3，5-二葡萄糖苷、紫蘇寧+矢車菊素3，5-二葡萄糖苷以及人參Rh2濃度均為10 μg/ml，PHA濃度為1%，經4天刺激誘導正常人外周淋巴細胞以后免疫效應細胞組成格局變化見表2。矢車菊素3，5-二葡萄糖苷對CD8+T和NK細胞增殖具有顯著上調作用(P＜0.05);PHA對CD8+、NK細胞和NKT細胞增殖具有顯著上調作用(P＜0.01～0.05);人參Rh2對NKT細胞增殖具有顯著上調作用(P＜0.01)。

表1 不同濃度的紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷對免疫效應細胞增殖格局的作用(%，x±s)Tab．1 Change of immunologic effector cells stimulated by different concentrations of Shisonin and Cyanidin(%，x±s)

表2 不同刺激物對免疫效應細胞格局的作用比較(%，x±s)Tab．2 Effect of different stimulus to the pattern of immunologic effector cells(%，x±s)

2.4 紫蘇寧和矢車菊3，5-二葡萄糖苷等刺激不同時間后結果比較 以紫蘇寧、矢車菊素3，5-二葡萄糖苷、紫蘇寧+矢車菊素3，5-二葡萄糖苷、PHA和人參Rh2等刺激淋巴細胞誘導培養4天與7天，比較各刺激物對免疫效應細胞的持續刺激效應。紫蘇寧對CD4+T細胞、CD8+T細胞、NKT細胞的刺激后細胞增殖百分率自第4天到第7天分別為:49.81±4.42(%)到62.75±5.24(%);25.55±1.56(%)到70.32±5.15(%);0.38±0.12(%)到1.51±0.22(%)，均呈上升趨勢(P＜0.05)。矢車菊素3，5-二葡萄糖苷對CD8+T細胞刺激后細胞增殖百分率自第4天到第7天為38.51±2.34(%)到63.03±4.42(%)，呈上升趨勢(P＜0.01)。PHA和人參Rh2在第4天到第7天未見持續性刺激效應。

3 討論

在腫瘤過繼性細胞免疫治療中，需要回輸大量具有殺腫瘤效應的淋巴細胞。為了快速、經濟地誘導免疫效應細胞增殖，本實驗以紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷刺激正常人外周單個核細胞，刺激培養4、7天以后觀察其T細胞亞群、NK細胞以及NKT細胞的刺激增殖作用，結果顯示紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷對CD4+T細胞和CD8+T細胞的增殖作用呈現隨刺激物濃度升高而增強的趨勢，矢車菊素3，5-二葡萄糖苷對NK細胞具有刺激生長作用，而紫蘇寧與矢車菊素3，5-二葡萄糖苷等比例混合沒有發揮互補的刺激作用，初步證實了紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷具有誘導CD3+T細胞、CD8+T細胞和NK細胞增殖的作用。體外細胞培養時間延長會導致其活力下降，紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷可以抵抗自由基對脂肪、蛋白質和核酸的氧化性損害，實驗顯示紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷對細胞的刺激增殖作用隨時間延長而更顯見。但是紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷在免疫細胞培養中的作用是刺激細胞增長還是抗氧化保護或兼而有之尚待進一步證實。

PHA是人T淋巴細胞非特異性促有絲分裂原，可用于制備CD3AK細胞［5］。本實驗發現，單個核細胞經1%PHA刺激4天后，NK細胞和NKT細胞的增殖率明顯高于對照組，7天以后，CD3+T細胞和CD4+T細胞數逐漸降低。說明PHA在短期內可以刺激細胞生長，尤其是NK細胞和NKT細胞，長期刺激對CD4+T細胞和CD8+T細胞增殖的效果卻遜于紫蘇寧和矢車菊素3，5-二葡萄糖苷。人參皂苷Rh2具有誘導腫瘤細胞的逆轉和調節免疫功能的作用［6-8］。以Rh2作為刺激物，對單個核細胞4天誘導培養后可以明顯刺激NKT細胞增殖(P＜0.01)，7天則可以刺激CD4+細胞和CD8+細胞增殖。2個時間段未見對NK細胞有誘導作用。NKT細胞是一種特定的異質性T細胞亞群，兼有NK細胞和T細胞的某些特征。NKT細胞在發揮殺傷作用時不受MHC限制，激活的NKT細胞可以釋放大量細胞因子，增強機體抗感染和抗腫瘤的作用［9，10］。本文初步證明人參皂苷Rh2對CD8+T細胞和NKT細胞具有增殖效應。以花青素、PHA、人參Rh2組合取代細胞因子誘導免疫效應細胞不僅有效且更經濟，具有良好的應用前景。

過繼性細胞免疫治療還須考慮Treg細胞、γδT細胞、DC細胞甚至B淋巴細胞在抗腫瘤過程中所扮演的角色［11，12］，探究紫蘇寧、矢車菊素 3，5-二葡萄糖苷對上述細胞的作用同樣具有實用意義。

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