真鱈魚骨明膠的提取工藝及性質研究*

王珊珊，單銀銀，李志皓，喬若瑾，李八方

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島，266003)

真鱈魚骨明膠的提取工藝及性質研究*

王珊珊，單銀銀，李志皓，喬若瑾，李八方

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島，266003)

以真鱈魚骨為原料對其明膠的提取工藝進行了研究。在單因素實驗基礎上，通過正交實驗探討HCl濃度、酸處理時間、提取溫度和提取時間對魚骨明膠得率的影響。結果表明:HCl濃度4%，酸處理時間18 h，提取溫度70℃，提取時間8 h，明膠提取率最高，達98.02%。明膠在235 nm處有最大吸收。在上述提取條件下，得到的明膠經紅外光譜檢測失去三螺旋結構，在掃描電鏡觀察下明膠具有多孔的網狀結構。

真鱈魚骨，明膠，提取，得率

明膠是一種重要的高分子蛋白質，含有除色氨酸之外的所有必需氨基酸。明膠是用動物(主要是豬和牛等)的結締組織(如皮、骨、筋腱、韌帶等富含膠原的組織)經酸法或堿法預處理后抽提制成。明膠因具有獨特的理化性質和較好的生物相容性，因而被廣泛應用于食品、醫藥、化妝品、照相材料等領域，近年來全球對明膠的需求量持續增長。隨著瘋牛病和口蹄疫等人畜共患疾病的出現，傳統明膠的安全性受到廣泛質疑。水產來源的明膠不僅具有更好的安全性，還可迎合部分地區的宗教需求，有利于水產加工副產物(魚皮和魚骨)的高值化利用，具有廣闊的市場前景。

目前水產來源明膠原料主要是魚皮[1-3］，而使用魚骨提取明膠的研究還較少。太平洋真鱈(Gadus macrocephalus)是重要的商業捕撈魚種，目前我國對真鱈的加工主要集中在利用其魚肉進行鱈魚魚片的生產，產生的廢棄物如皮、骨等盡管具有較高的營養價值，但僅有一部分用于小食品和低值魚粉的生產。因此，從水產加工副產物魚骨中提取明膠，既能增加產品的附加值，同時可以擴大明膠的原料選擇，減少資源的浪費。本實驗著重研究從太平洋真鱈魚骨中提取明膠的最佳工藝及明膠的主要性質，為實現魚骨明膠的產業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

太平洋真鱈(Gadus macrocephalus)魚骨取自青島福生食品有限公司，真鱈來源于白令海。原料獲取后去除雜質，冷藏于-18℃冰箱中備用。

乙二胺四乙酸二鈉、HCl、氯胺T、對二甲氨基甲醛等試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司出品。

1.1.2 儀器與設備

電熱恒溫水浴鍋(HHS-Ni)，北京長安科學儀器廠制造;冷凍干燥機(Alpha 1-4 LD型)，德國CHRIST公司制造;紫外分光光度計(UV-2102PC型)，尤尼柯(上海)儀器有限公司制造;傅立葉紅外光譜儀(Nicoletnexos型)，美國Nicolet公司制造;掃描電子顯微鏡(JSM-840)，日本JEOL公司出品。

1.2 實驗方法

1.2.1 基本成分測定

水分測定:恒溫干燥法(GB/T 5009.3-2003);蛋白質測定:凱氏定氮法(GB/T 5009.5-2003);脂肪測定:乙醚抽提法(GB/T 5009.6-2003);灰分的測定:灰化法(GB/T 5009.4-2003);羥脯氨酸測定:依照ISO3496:1978(E)[4］方法進行測定。

1.2.2 魚骨明膠提取

1.2.2.1 明膠提取的工藝流程

冷凍魚骨→清洗，去雜質→NaOH溶液處理→水洗至中性→EDTA溶液處理→鹽酸處理→水洗至中性→勻漿→提膠→離心→真空濃縮→冷凍干燥→成品明膠

1.2.2.2 明膠提取率

式中:T，明膠提取率，%;A，提取明膠中的羥脯氨酸含量，g;B，原料中羥脯氨酸的含量，g。

1.2.2.3 單因素實驗

太平洋真鱈魚骨明膠單因素實驗的基本條件設定為:HCl質量分數為4%，酸處理時間為12 h，提取溫度為50℃，提取時間為6 h，提膠料液比為1∶10。改變其中一個條件，固定其他條件以分析HCl質量分數、酸處理時間、提取溫度、提取時間及提膠料液比對明膠得率的影響。實驗重復3次，結果取平均值。

1.2.2.4 正交實驗設計

根據單因素實驗結果，以明膠得率為指標，對酸質量分數、酸處理時間、提取溫度和提取時間4個因素設計正交實驗L9(34)。實驗重復3次，結果取平均值，對實驗結果進行統計分析，優化提取工藝。

1.2.3 明膠的紫外光譜掃描

將提取得到的明膠樣品溶解于0.5 mol/L醋酸溶液中，配制成1 mg/mL的明膠溶液，使用UV-2550紫外分光光度計在200～400 nm近紫外光區以120 nm/min的速度進行掃描。

1.2.4 傅立葉紅外光譜(FTIR)分析

在干燥條件下，將適量樣品和KBr在瑪瑙研缽中充分研磨混勻。取樣品手動壓片，將樣品放入樣品室，使用Nicolet-200SXV傅立葉紅外光譜儀對樣品在4000～500 cm-1區間掃描，分辨率設置為2 cm-1。

1.2.5 掃描電鏡觀察

取冷凍干燥樣品固定后真空噴金處理，加速電壓為20 kV，以JSM-840型掃描電子顯微鏡觀察樣品的顯微結構。

2 結果與分析

2.1 鱈魚骨基本成分測定

本實驗所測得的真鱈魚骨基本組成成分見表1。

表1 鱈魚骨基本組成成分

該魚骨中粗蛋白含量17.3%，灰分14.7%，水分含量64.2%，脂肪含量1.2%，羥脯氨酸含量1.2%。羥脯氨酸是膠原蛋白的特征氨基酸，通過測定羥脯氨酸的濃度可以得到膠原蛋白的大致含量。一般對水生動物換算系數通常采用11.1[5］，得出鱈魚骨中的膠原蛋白含量約為13.3%，約占總蛋白的77%。因此，魚骨可作為一種較好的明膠提取原料。

2.2 酸質量分數對明膠得率的影響

經EDTA溶液脫鈣處理后，魚骨色澤潔白，感官評價較軟。直接對脫鈣后的魚骨進行熱水抽提明膠得率極低，這是因為脫鈣魚骨組織結構緊密，單純的熱處理無法有效破壞組織中膠原蛋白的氫鍵和共價鍵，膠原難以轉化成明膠被提取出來。因此，首先需用酸溶液對原料進行溶脹處理。酸處理可以打開膠原端肽區的交聯、膠原三螺旋結構的酰胺鍵以及膠原分子內和分子間的氫鍵、共價鍵和非共價鍵，從而使原料溶脹進而提高熱水抽提的提取率[6］。

圖1 酸質量分數對明膠提取率的影響

實驗分析了酸質量分數在1%～5%內對明膠提取率的影響。實驗結果如圖1所示，HCl濃度在小于2%時，明膠得率增加緩慢。這是因為在原料中，膠原在分子內、分子間以及端肽區具有大量由氫鍵、共價鍵和非共價鍵所形成的交聯[6］，低濃度的酸溶液無法有效打開這些交聯;當濃度大于2%時，膠原分子內和分子間的離子交聯和氫鍵交聯被充分打開，熱水處理時水分子能輕易進入膠原分子鏈的間隙，有效促進了熱力對氫鍵和非共價鍵的斷裂，從而提高顯著明膠得率。在酸質量分數為4%時明膠得率達到高值;但當酸濃度繼續增加時明膠的提取率會有所下降，這可能是因為濃度過大反而會致使酸溶性的膠原在處理過程中溶解到酸溶液中或被直接酸解。因此酸質量分數在3.5%左右較為合適。

2.3 酸處理時間對明膠得率的影響

實驗分析了4～20 h內不同酸處理時間對明膠提取率的影響。從圖2中可以看出，酸處理時間在16 h以內時，明膠的得率一直在顯著上升。這是因為脫鈣后的原料雖然變軟，但結構仍較為致密，酸溶液需要一定的時間對其進行溶脹;當酸處理時間達到16h時，酸溶液對膠原分子的溶脹較為充分，明膠提取率達到最高;但當酸處理時間進一步提高時，得率卻再無顯著變化。繼續進行酸處理，酸對膠原的溶脹作用已經結束，而膠原分子可能會由于過長時間的酸處理而被部分降解成分子質量更小的肽鏈，溶解在酸溶液中進而造成膠原的損失。因此，酸處理的理想時間為16 h為宜。

圖2 酸處理時間對明膠提取率的影響

2.4 提取溫度對明膠得率的影響

實驗分析了在40～80℃內提取溫度對明膠提取率的影響，實驗結果如圖3所示。當原料經充分溶脹后，加熱可以有效斷裂膠原分子端肽區域及三螺旋結構區域的次級鍵，使膠原溶出轉變為明膠。由圖3可以看出，明膠的得率隨溫度的升高而升高，溫度達到70℃時明膠提取率高達94.3%;當提取溫度進一步升高時，明膠得率增加不顯著。提高提取溫度可大大縮減提取時間并提高明膠得率，但相應會加速明膠的次級水解，使明膠的黏度和凝膠強度下降[7］。由此可見，魚骨明膠提取溫度為70℃較為合適。

圖3 提取溫度對明膠提取率的影響

2.5 提取時間對明膠得率的影響

圖4 表明，明膠提取率隨著提取時間的增加而明顯提高，當時間達到8 h時明膠得率達到57.8%。當提取時間繼續增加時，明膠得率變化不大。熱水抽提時間過短，明膠無法充分提取出來，得率太低;時間過長則會使明膠過度水解[8］，降低明膠的理化性質。因此，魚骨明膠較合適的提取時間為8 h為宜。

2.6 提膠料液比對明膠得率的影響

料液比是影響明膠提取率的因素之一，合適的料液比可以使原料中的明膠得到充分提取。由圖5可知，明膠得率在料液比1∶6時達到最高。料液比較低時，由于體系內溶劑含量少，不利于原料在溶劑中得到充分震蕩，得率較低。當料液比超過1∶6時，其提取效率增加幅度不大，也會增加后續離心、濃縮等工藝步驟的工作量。因此，料液比選為1∶6比較合適。

圖4 提取時間對明膠提取率的影響

圖5 提膠料液比對明膠提取率的影響

2.7 魚骨明膠最優提取條件的選擇

表2 魚骨明膠提取正交實驗結果

在提取魚骨明膠時，既要盡可能提高產品得率，同時還要降低提取成本。采用正交實驗對提取條件進行優化，結果見表2。由極差R值可以看出，各因素對明膠得率的影響大小為提取溫度＞酸質量分數＞酸處理時間＞提取時間。因此，提取溫度對明膠得率的影響最為顯著。明膠得率極差分析最佳組合為A2B3C3D3，即酸質量分數4%，酸處理時間18 h，提取溫度70℃，提取時間8 h。在此優化條件下，明膠提取率為98.02%。

2.8 魚骨明膠部分性質研究

2.8.1 魚骨明膠基本成分測定

真鱈魚骨在最佳工藝條件下通過離心、濃縮、冷凍干燥后可以得到純度較高、色澤潔白、無異味的魚骨明膠。由表3可見，魚骨明膠蛋白質含量大約94.1%，羥脯氨酸含量約7.5%，明膠純度達到90.4%。

表3 魚骨明膠基本組成成分

2.8.2 紫外光譜分析

蛋白質分子中含有能吸收一定紫外波長光的紫外生色基團，例如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸在280 nm處有較強的紫外吸收，各種紫外生色基團的加和使得蛋白質溶液在紫外區存在一定的吸收[9］。由圖6可見，魚骨明膠的最大吸收波長約在235 nm處，這是明膠的特征吸收峰，主要是電子的N→л*和N→σ*躍遷所產生。魚骨明膠在280 nm處吸收較少，說明樣品只含有少量芳香族氨基酸，可以初步判斷所提取的明膠具有較高的純度。

2.8.3 傅立葉紅外光譜(FTIR)分析

傅立葉紅外光譜可用來研究膠原蛋白和明膠二級結構的變化。在紅外光譜中可以表示蛋白質二級結構變化的區域主要是酰胺A[10］，酰胺I(1636～1661 cm-1)，酰胺II(1549～1558 cm-1)[11］和酰胺III(1200～1300cm-1)[12］。其中，酰胺I帶是蛋白質多肽骨架CO伸縮振動產生，是研究蛋白質二級結構變化的最有效區域[13］。由圖7可見，與酸法[14］提取的未變性酸溶性膠原蛋白(B)相比，熱水抽提明膠(A)的酰胺A吸收峰變寬，而酰胺I(1648.46 cm-1)、II(1540.64 cm-1)、III(1237.83 cm-1)峰值強度明顯減少。這些變化表示，明膠分子失去了三螺旋結構而轉變為無序狀態[12］。

圖6 魚骨明膠的紫外吸收光譜

圖7 骨明膠的傅立葉紅外(FTIR)光譜圖

2.8.4 掃描電鏡觀察

圖8 魚骨明膠的掃描電鏡(SEM)圖

如圖8所示，在掃描電鏡下魚骨明膠具有細小連續孔的網狀結構，這些孔徑的大小與制備明膠過程中水分含量的多少有關。這種有序的多孔海綿狀結構可以有效容納固體及液體微粒。因此，通過調節孔徑的大小，明膠能夠作為藥物的新型載體在醫學領域得到廣泛的開發和應用[15］。

3 結論

在單因素實驗的基礎上采用正交實驗確定了真鱈魚骨提取明膠的最佳條件:HCl質量分數4%，酸處理時間18 h，提取溫度70℃，提取時間8 h，明膠提取率可達98.02%。經過離心、濃縮、干燥后得到白色、無異味的魚骨明膠，其純度達到90.4%。經紫外光譜掃描，明膠在235 nm處有最大吸收，在280 nm處吸收較少。紅外光譜檢測發現明膠失去三螺旋結構。在掃描電鏡觀察下明膠具有多孔的網狀結構。

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ABSTRACTAquatic gelatin was prepared from the bone of Pacific cod.The influences of different extraction parameters，including concentration of hydrochloric acid，acid soaking time，extraction temperature and time on the extraction rate of bone gelatin were investigated.On the base of single-factor experiment，the optimum parameters of extraction for bone gelatin were obtained by orthogonal experiment as follows:the concentration of hydrochloric acid 4%，acid soaking time 18h，the extraction temperature 70℃and time 8h，the yield was 98.02%.Gelatin exhibited the maximum absorbance at 235nm.FTIR spectra showed the significant loss of molecular order of triple helix.The gelatin displayed a polyporous network under SEM.

Key wordscod bone，gelatin，extraction，yield

Study on the Extraction and Property of Gelatin from Pacific Cod Bone

Wang Shan-shan，Shan Yin-yin，Li Zhi-hao，Qiao Ruo-jin，Li Ba-fang
(College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China)

博士研究生(李八方教授為通訊作者，Email:bfli@ouc.edu.cn。)。

*國家自然科學基金(30871943)狹鱈魚皮膠原蛋白分子結構與物理及其耦合性的研究

2011-10-10，改回日期:2011-12-12